微波水解-液相色谱-原子荧光光谱法测定硒蛋白中的硒代氨基酸

刘 瑶 杜兴媛 张朝阳 刘淑琴 陈 娥 胡百顺 刘小芳 秦 邦 刁 英 靳素荣 胡中立 陈永波*

(1.恩施土家族苗族自治州农业科学院，湖北 恩施 445000；2.武汉轻工大学 生命科学与技术学院，武汉 430048；3.武汉大学 生命科学学院，武汉 430072)

硒是人体所必需的一种微量元素，而硒的形态是影响生物对其吸收和利用的重要因素[1-2]。生物大分子结合态有机硒安全、生物活性好、吸收率较高，所以有机硒补剂产品的开发和研究受到了广泛关注[3]。在富硒食品、药品、营养品和保健品的开发研制过程中对产品硒含量和硒形态的检测显得尤为重要[4]。硒蛋白是有机硒的主要存在形式之一，硒仅以硒代胱氨酸(Selenocystine，SeCys2)和硒代蛋氨酸(Selenomethionine，SeMet)两种形式共价结合在蛋白质中[5]，植物体中通常存在游离态的甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine，MeSeCys)[6]。硒代氨基酸的测定需经过提取、分离、检测三个步骤，其中提取技术最基础也最为关键，主要有水提法、酸提法、酶提法[7-8]。水提法只能提取水溶性硒代氨基酸，结合态蛋白硒提取率低；传统酸解法是在氮气环境下110 ℃水解22 h，但研究发现，在长时间的盐酸水解过程中，硒代氨基酸与含硫氨基酸、色氨酸一样不稳定，几乎完全被破坏；酶解法是目前采用最多的方法，但酶解法操作复杂，时间长，水解不完全，单个样品检测成本高，限制了该方法在生产上的应用[9]。

高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)有着分离效率高和分析速度快等优势，是常见的分离技术[10]。相比于GC，HPLC对于样品的热稳定性要求更低，应用范围更广[11-12]。原子荧光光谱法(AFS)是一种成熟且灵敏的硒形态检测技术[11-12]，因为它可以通过氢化物生成技术大大提高硒形态的灵敏度，且具有操作简单、运行成本低等优点[13]，因此将HPLC和AFS 联用进行硒的形态分析在线性和检测限方面均提供了良好的分析特性。

微波辅助蛋白质水解法因其快速高效已经得到广泛的应用[14-18]，有研究表明可通过微波辅助蛋白质水解稳定提取色氨酸[19-21]，但通过微波水解硒蛋白稳定提取硒代氨基酸的方法未见报道。因此，本研究采用星点设计-响应面法优化微波水解硒蛋白的条件，利用HPLC-HG-AFS法进行硒形态分析，为硒蛋白中硒代氨基酸的测定提供简便、快速、可行的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国Waters 2695分离单元)，AFS-930d原子荧光光谱仪，配有形态分析预处理装置(SAP-10，北京吉天仪器有限公司)，Ethos UP微波蛋白水解仪(意大利Milestone公司)。

GBW 10034硒代蛋氨酸(国家标准物质中心，39.4 μg/g)，GBW 10087硒代胱氨酸(国家标准物质中心，44.2 μg/g)，GBW 10088甲基-硒代半胱氨酸(国家标准物质中心，34.8 μg/g)。

1.2 样品前处理

称取硒蛋白粉(市售)20 mg于石英插杯内，加入1 mL 盐酸(6 mol/L)，置于微波蛋白水解仪中，氮气保护，150 ℃水解40 min，水解后转移样品溶液并用氢氧化钠溶液调节pH值至7.5，用水定容至25 mL，用0.45 mm滤膜过滤，待测。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：XP阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)，流动相为(NH4)2HPO4(40 mmol/L)，用甲酸调节pH=6.0，等度洗脱，流速0.7 mL/min。

1.3.2 氢化物发生条件

还原剂：KOH(5 g/L) +KI(20 g/L)，KOH(5 g/L) +KBH4(15 g/L)，载流HCl(10%)，紫外灯开/关为开。

1.3.3 原子荧光光谱条件

硒空心阴极灯，负高压300 V，灯电流(总电流/辅电流)80/40 mA，载气300 mL/min，屏气600 mL/min。

1.4 标准溶液的配制

硒代胱氨酸标准储备溶液(8.84 μg/mL)：将硒代胱氨酸标准溶液2 g 转入10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀。

甲基-硒代半胱氨酸标准储备溶液(6.96 μg/mL)：将硒代胱氨酸标准溶液2 g转入10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀。

硒代蛋氨酸标准储备溶液(7.88 μg/mL)：将硒代甲硫氨酸标准溶液2 mL转入10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀。

标准工作溶液：吸取硒代胱氨酸储备液1.13 mL、甲基-硒代半胱氨酸储备液1.44 mL、硒代蛋氨酸储备液1.27 mL于10 mL容量瓶中，用水定容，配置成混合标准工作液，SeCys2、MeSeCys和SeMet质量浓度(以硒计)分别为1.00、1.00、2.00 μg/mL。

2 结果与讨论

2.1 水解液pH值对硒代氨基酸含量的影响

水解液pH值是影响分离效果与保留时间的重要因素，因此探索水解液pH值对硒代氨基酸含量测定的影响。硒蛋白水解液为强酸溶液，考虑到流动相pH值为6.0，实验调节pH至6.0～8.0，观察pH值对水解硒代氨基酸的影响，结果见表1。从表1中可以看出，水解液pH值对硒代氨基酸和3种形态硒之和(TSe)均有影响，随着pH值升高，SeCys2与SeMet的值在7.0～7.5之间趋于稳定，TSe的值在7.5～8.0段趋于稳定，综合考虑硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的与TSe稳定性，而且pH=7.5时，TSe与GB 5009.93—2017测定硒蛋白总硒2 408.55 mg/kg接近，因此调节水解液pH值为7.5。

表1 水解pH值对硒代氨基酸和TSe的影响Table 1 The influence of hydrolysate pH on selenoamino acid and TSe

2.2 星点设计-响应面法优化硒蛋白的水解条件

为进一步优化硒蛋白水解的条件，本文采用星点设计-响应面优化法，以微波水解温度(A)、微波水解时间(B)和称样量(C)为自变量，水解液中TSe为因变量，对自变量各水平进行多元线性回归和二拟合，用响应面法选择最佳的水解条件。

2.2.1 实验因素水平设置

实验因素与相应的水平如表2所示。

表2 响应面实验因素和水平表Table 2 Response surface experimental factors and level table

2.2.2 实验结果

表3为响应面实验设计对3种硒形态和总硒的测定结果。

表3 响应面法实验设计对硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和总硒的测定结果Table 3 Response surface method experimental design SeCys2，MeSeCys，SeMet and TSe determination results

2.2.3 不同因素间的响应面分析

根据表3的结果，模型中各因素间的交互作用如图1所示。

响应面越陡，表明两因素间的交互作用越显著。从图1(a)可以看出，水解温度最佳在145～155 ℃，水解时间为37～40 min；从图1(b)看出，最佳水解温度为150～170 ℃，称样量为17.5～25.0 mg；从图1(c)看出，最佳水解时间为38～40 min，称样量为17.5～22.5 mg。

图1 硒白水解温度(A)、时间(B)和称样量(C)之间的响应面Figure 1 The response surface of selenoprotein hydrolysis temperature(A)，time(B) and sample weight(C).

2.2.4 响应面回归模型的方差分析

运用Design-expert 8.05b软件采用Box-Behnken Design(BBD)设计对表3中数据进行响应面分析，通过多元回归拟合分析得到模型并进行方差分析，得到硒蛋白水解的优化数学回归方程为：

R=2525.97+45.10A+332.83B+9.25C-256.38AB+199.38AC-43.14BC-284.05A2+398.01B2-743.82C2

式中：R为水解液中TSe的含量，mg/kg；A为水解温度，℃；B为水解时间，min；C为称样量，mg。对模型进行F检验和方差析，结果见表4。

表4 响应面回归方程的方差分析Table 4 Analysis of variance in response surface regression equation

由表4中方程一次项系数得出，影响硒代蛋氨酸含量测定的影响力顺序为：水解时间A>水解温度B>称样量C。如表4中方差结果分析显示：回归方程的F值5.72，Prob>F项的值小于0.05，说明该模型极显著，B小于0.05，影响显著。经过响应面分析及回归模型预测，得到硒蛋白最佳水解条件为：水解温度149.04 ℃，水解时间40.00 min，称样量19.24 mg，水解硒代氨基酸总量预期值为3 300.22 mg/kg，与采用国标法测定硒蛋白中总硒含量3 084.56 mg/kg相对偏差6.76%，说明该条件适合硒蛋白的水解。结合实际操作，为了便于操作，最终确定水解条件为水解温度150 ℃，水解时间40 min，称样量20 mg。

2.3 方法的线性范围和检出限

将标准混合液分别进样0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μL，所得原子荧光光谱图如图2所示。以含硒量与峰面积制作标准曲线，得到回归方程和相关系数如下：

图2 硒代氨基酸混合标准样品的原子荧光光谱图Figure 2 Atomic fluorescence spectrum of selenoamino acid mixed standard sample.

SeCys2：y=12983.0x+1455.8，R2=0.9996；

MeSeCys：y=9641.4x-15961.2，R2=0.9991；

SeMet：y=1725.6x-18528.6，R2=0.9992。

3种硒代氨基酸相关系数均大于0.999，表明硒代氨基酸质量在0～100 ng之间线性范围良好。

按称样量20 mg、水解液定容至25 mL计算，将水解液连续进样10次，进样量20 μL，以峰面积为准计算标准偏差(SD)，根据曲线斜率(S)和标准偏差计算检测限LOD=3S/SD，方法检出限LOD(SeCys2)=0.07 mg/kg，LOD(MeSeCys)=0.03 mg/kg，LOD(SeMet)=0.14 mg/kg。

2.4 方法的准确度和精密度

因没有硒蛋白标准物质，以国家标准方法GB 5009.93—2017三次测定的总硒平均值作为样品的真值，以硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱酸、硒代蛋氨酸3种形态硒之和(TSe)作为实测值，得出实测值与真值的相符程度，其准确度结果由TSe/总硒×100%表示。

按照实验方法对样品进行处理，重复6次，考察方法的准确度和精密度，结果见表5。方法的准确度为89.7%～94.4%，3种硒代氨基酸TSe的RSD为2.3%～5.6%，说明本方法具有良好的准确度与精密度。

表5 方法的准确度和精密度Table 5 Accuracy and precision of method

2.5 实际样品的测定

应用本方法对3份市售硒蛋白进行测定，3份样品中均检测出硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸，检测结果如表6所示。

表6 硒蛋白样品测定结果Table 6 Determination results of selenoprotein samples

3 结论

建立了一种用盐酸(6 mol/L)微波水解-高效液相-原子荧光光谱法检测硒蛋白中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸3种硒代氨基酸含量的方法，规避了传统酸水解法水解时间长、硒代氨基酸在水解过程中不稳定的技术难题；与酶解法相比，缩短了水解时间且水解更完全，水解产物仅含硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱酸、硒代蛋氨酸这3种硒代氨基酸。

采用高效液相-原子荧光光谱法检测硒蛋白中3种硒代氨基酸含量，测定周期仅12 min。每个样品分析成本低于200元。该方法操作简单，准确度高，适用于硒蛋白样品分析，能够科学评价硒蛋白中硒代氨基酸的组成，对硒蛋白产品的质量控制和溯源提供了科学方法。

目前该方法适用于硒蛋白和硒蛋白含量高的样品分析，对于硒蛋白含量低的富硒食品、富硒产品还需进一步研究。若能解决低硒蛋白的样品中硒代氨基酸的测定，再结合富硒食品中无机硒的测定方法，可以区分有机硒和无机硒、蛋白硒和非蛋白硒，准确评价富硒产品的补硒效果和富硒生物资源的开发应用价值，促进硒产业的发展。