国产与进口DMEM 培养ST 细胞及应用效果比较

何锡忠，李嘉皓，林 鸷，赵本进，朱永军，彭丽英*

(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

病毒是专性寄生物，自身无完整的酶系统，不能进行独立的物质代谢，必须在活的宿主细胞内才能进行生长、复制和增殖。自20世纪40 年代末首次发现脊髓灰质炎病毒在体外非神经组织上生长复制以来，细胞培养已成为培养病毒的主要方法[1]。培养基是维持宿主细胞生存和生长所需的基本溶液，国产与进口都属于合成达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)，是按人和动物体内细胞所需成分模拟合成、配方恒定的一种较理想的培养基。合成培养基的出现促进了组织培养的发展，减少了生物个体差异的影响[2]。目前培养猪睾丸(swine testis，ST)细胞的DMEM 主要依赖进口，价格昂贵，而且受限因素很多。近几年，国产DMEM 发展迅速。本研究对国产和进口DMEM 培养ST 细胞的效果进行比较，并对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和猪传染性胃肠炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus，TGEV)在国产和进口培养基培养的ST细胞中敏感性进行分析，以期为国产DMEM 大规模培养病毒等提供科学依据。

1 试验材料

1.1 细胞和病毒毒株

ST 细胞株购自湖南丰晖生物科技有限公司。PRVsx-gE、PPV 和TGEV 毒株由上海市农业科学院动物疾病诊断检测中心保存。

1.2 试剂及耗材

进口DMEM、新生牛血清、胰酶购自GIBCO公司，国产DMEM 由上海源培生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要仪器

CO2培养箱购自Thermo公司；Retiga 2000R 高敏感度冷荧光数码显微镜购自日本奥林巴斯公司。

2 试验方法

2.1 ST 贴壁细胞培养

取形成致密单层的适量T-75 方瓶ST细 胞，用含0.2%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 的PBS清洗3 次，加入 0.25%胰酶消化片刻，倾去胰酶，分别用含10%新生牛血清的国产与进口DMEM 制备成细胞悬液，将细胞初始接种密度统一为0.25×106个/mL，每组重复做4 瓶，37 ℃培养72 h。

2.2 ST 贴壁细胞连续传代

细胞培养成致密单层后，按照“2.1 ST贴壁细胞培养”中的方法消化ST 贴壁细胞，分别用含10%新生牛血清的国产与进口DMEM制备成细胞悬液，将细胞初始接种密度调整为0.25×106个/mL，每组重复做3 瓶，取其平均数，37 ℃培养72 h 后传代，连续传10 代。观察不同DMEM 对细胞连续传代的影响。

2.3 病毒培养试验

分别取国产与进口DMEM 培养的致密单层的适量T-75 方瓶ST 细胞，按照“2.1 ST 贴壁细胞培养”中的方法消化ST 贴壁细胞，分别用含10%新生牛血清的国产与进口DMEM 制备成细胞悬液，按1∶4 接种传代，37 ℃培养48 h，弃培养基后加入适量PBS 洗涤3 次，分别接种培养PPV、PRV 和TGEV，具体操作如下：

2.3.1 ST 细胞接种PPV

取洗涤好的ST 细胞各3 瓶，每瓶按1%接种PPV 工作种毒，37 ℃恒温箱内吸附1.5 h，向瓶内分别加入国产或者进口DMEM 的细胞维持液(含1%～2%的犊牛血清) 至10 mL，使维持液中毒种含量为0.1%，37 ℃恒温箱培养96 h。观察到50%以上的细胞出现明显病变时收获，反复冻融3 次后测定滴度。

2.3.2 ST 细胞接种PRV

取洗涤好的ST 细胞各3 瓶，每瓶按1%接种PRV 工作种毒，37 ℃恒温箱内吸附1 h，向瓶内分别加入国产或者进口DMEM 的细胞维持液(含1%～2%的犊牛血清) 至10 mL，使维持液中毒种含量为0.1%，37 ℃恒温箱培养48 h。观察到70%以上细胞出现拉丝变长、拉网脱落现象时收获，反复冻融3 次后测定滴度。

2.3.3 ST 细胞接种TGEV

操作同上，观察到70%以上细胞呈颗粒状、拉网脱落现象，液相的透明度浑浊(但不是污染的云烟状)时收获，反复冻融3 次后测定滴度。

2.4 细胞密度和TCID50 测定

用含0.2% EDTA 的PBS 清洗3 次，加入0.25%胰酶消化片刻，倾去胰酶，用DMEM 制备成细胞悬液，取样后用含10 g/L 结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血细胞计数板计数细胞。TCID50测定按照常规方法测定。

3 结果与分析

3.1 ST 贴壁细胞培养情况

由表1 可知，用国产与进口DMEM 培养ST细胞，72 h 后细胞均增殖到1.25×106个/mL以上，增加了5 倍多，两者无显著差异(P＞0.05)，表明国产DMEM 适合用于ST 贴壁细胞培养。

3.2 ST 细胞连续传代情况

结果(表2) 显示，用国产DMEM 静止培养72 h，第1 代～第10 代细胞密度均达到1.25×106个/mL 以上，与进口DMEM 相似，两者无显著差异(P＞0.05)，表 明国产DMEM 也可以连续传代培养ST 细胞。

3.3 PPV、PRV 和TGEV 在ST 细胞中的增殖

如表3 所示，两种培养基培养同一病毒的滴度相近，两者无显著差异(P＞0.05)，初步表明PPV、PRV 和TGEV 在用国产DMEM 培养的ST 细胞中能正常增殖。

4 结论与讨论

为了评价国产DMEM 的质量，以进口DMEM为对照，比较两种培养基培养ST 细胞的生长状态和几种病毒在ST 细胞中增殖的一致性。本试验结果表明，国产DMEM 培养ST 细胞的生长状态与进口DMEM 相似，用国产DMEM 培养ST 细胞来增殖PPV、PRV 和TGEV，均能到达毒价标准。

李建平等[3]比较了国产与进口DMEM 培养CHO-C28 细胞的培养上清中HBsAg 表达水平，发现国产培养基略好于进口培养基，二者纯化图谱和抗原电泳图谱一致。

用原来过滤系统除菌过滤培养基，进口培养基通透性优于国产，可能是添加的营养成分不同所致；更换过滤系统后二者通透性基本一致。

综上所述，通过利用国产DMEM 培养ST 细胞及应用于PRV、PPV 和TGEV 的增殖培养，国产DMEM 达到了进口培养基水平，可用于规模化生产。