冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白A水平与病情程度及预后的关系

楚艳贞，于林君，张彦昂

冠心病是一种以动脉粥样硬化病变、冠状动脉管腔狭窄、心肌供血减少为主要病理特征的心脑血管疾病[1]。病人临床表现为胸闷、胸痛等，严重者会伴有心源性哮喘、晕厥等心肌梗死症状。目前，冠状动脉造影检查是临床诊断冠心病的金标准，可准确、直观显示犯罪血管，但因其属于有创检查且费用相对较高，加之心肌本身存在代偿功能，发病早期不易被发现，延误诊断与治疗，增加主要心血管不良事件(MACE)发生风险[2-3]。因此，探讨简便易行且灵敏度高的生物标志物对早期诊断冠心病及预后评估尤为关键。冠心病的主要病因在于冠状动脉病变，其中炎症反应、脂质代谢异常等与冠状动脉粥样硬化的发生、发展密切相关[4]。miR-342-5p是早期巨噬细胞丰富病变中高度上调的miRNA之一，广泛参与炎症反应、糖脂代谢过程，其可通过介导炎症反应而发挥抑制蛋白激酶 B1(Akt1)蛋白磷酸化及破坏心肌细胞的作用[5]。潜在转化生长因子结合蛋白2(LTBP-2)属于细胞外基质糖蛋白之一，参与弹性纤维凝聚、细胞黏附、机体损伤等过程[6]。细丝蛋白 A(细丝蛋白 A)可介导多种细胞活动，其高表达与炎症反应中内皮细胞迁移密切相关[7]。但目前临床上关于miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白 A水平变化与冠心病的关系尚未明确。本研究分析冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白 A水平与病情程度及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年5月—2020年11月于我院治疗的95例冠心病病人作为病例组，其中，男54例，女41例；年龄42～81(68.29±4.98)岁；体质指数(BMI)为(23.62±2.19)kg/m2，受教育年限为(10.03±2.46)年；高血压史26例，糖尿病史9例，饮酒史10例，吸烟史5例；疾病类型：稳定型心绞痛42例，不稳定型心绞痛30例，心肌梗死23例；心功能分级：Ⅱ级49例，Ⅲ级25例，Ⅳ级21例。另选取同期60名健康体检者作为健康组，其中，男34名，女26名；年龄45～79(69.54±5.25)岁；BMI为(22.62±2.59)kg/m2；受教育年限为(9.65±2.05)年。两组年龄、性别、BMI、受教育年限比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象自愿签署知情同意书，本研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 纳入标准 符合冠心病[8-10]相关诊断标准，并经冠状动脉造影检查，≥1支冠状动脉血管狭窄≥50%；能配合治疗及随访。

1.3 排除标准 伴有免疫系统疾病、血液系统疾病、感染性疾病；存在各种急性、慢性感染；既往有冠状动脉搭桥术、冠状动脉支架植入术等重大手术史或入组前6个月内接受手术治疗；伴有瓣膜性心脏病、心肌病、甲状腺疾病；恶性肿瘤；合并弥散性血管内凝血、休克等危重状态；近6个月出现脑梗死或新发脑出血；肝肾功能不全；妊娠期或哺乳期女性。

1.4 研究方法

1.4.1 miR-342-5p检测 采集两组空腹肘静脉血3 mL，置于EDTA抗凝试管，在4 ℃ 3 000 r/min环境下离心10 min，提取上清液。提取血浆中总RNA后参照说明书使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。使用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术(PRISM 7000型定量PCR仪)检测miR-342-5p表达水平。反转录体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，重复40个循环，采集荧光，以U6作为内参，U6：正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-342-5p：正向引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGG AGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAATCAC-3′，反向引物为5′-ACACTCCAGCTGGGAGGGGTGCTATCTGT-3′。采用2-ΔΔCt法计算miR-342-5p相对表达量。

1.4.2 血清指标检测 提取病人血清，通过酶联免疫吸附法(试剂盒购自美国Beckman公司)检测两组血清LTBP-2、细丝蛋白 A、Ⅰ型胶原羧基末端肽(ⅠCTP)、蛋白酶K(CatK)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、白介素(IL)-6、IL-10水平；使用双抗夹心酶联免疫吸附法(试剂盒购自湖南普拉特泽生物科技有限公司)检测两组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；采用免疫散射比浊法(试剂盒购自上海羽哚生物科技有限公司)测定超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。

1.4.3 Gensini评分 ①病变部位：左主干冠状动脉病变计5.0分；左前降支或回旋支近段计2.5分；左前降支中段计1.5分；右冠状动脉、左回旋支中远段、左前降支远段计1.0分；第二对角支与后侧支计0.5分。②狭窄程度：狭窄≤25%计1分；狭窄26%～50%计2分；狭窄51%～75%计4分；狭窄76%～90%计8分；狭窄91%～99%计16分；100%狭窄计32分。每处病变部位积分为病变部位评分与狭窄程度评分乘积，Gensini评分为所有病变部位积分之和。轻度：Gensini评分为1～20分；中度：Gensini评分为21～40分；重度：Gensini评分>40分。

1.4.4 随访 随访1年，统计病人心源性死亡、严重心律失常、病变血管再狭窄、心肌梗死等MACE发生情况。

2 结 果

2.1 两组miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A水平比较 病例组miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A水平均高于健康组，差异均有统计学意义(P<0.001)。详见表1。

表1 两组miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A水平比较(±s)

2.2 不同病变程度冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A及Gensini评分比较 重度组miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A及Gensini评分均高于中度组、轻度组，中度组miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A及Gensini评分均高于轻度组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 不同病变程度冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A、Gensini评分比较(±s)

2.3 不同病变程度冠心病病人斑块稳定性相关指标比较 重度组ⅠCTP、CatK、MMP-2、MMP-9均高于中度组、轻度组，中度组ⅠCTP、CatK、MMP-2、MMP-9均高于轻度组，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

表3 不同病变程度冠心病病人斑块稳定性相关指标比较(±s)

2.4 不同病变程度冠心病病人炎性因子水平比较 重度组TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-10水平均高于中度组、轻度组，中度组TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-10水平均高于轻度组，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表4。

表4 不同病变程度冠心病病人炎性因子水平比较(±s)

2.5 冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A与病情相关指标的相关性 相关性分析显示，冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A与Gensini评分、斑块稳定性相关指标、炎性因子指标均呈正相关(P<0.05或P<0.01)。详见表5。

表5 冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A与病情相关指标的相关性分析

2.6 不同预后冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A比较 MACE组miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A均高于非MACE组，差异均有统计学意义(P<0.001)。详见表6。

表6 不同预后冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A比较(±s)

2.7 miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A预测冠心病发生及预后的价值 绘制ROC曲线，miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A及三者联合预测冠心病发生的AUC分别为0.809，0.779，0.770，0.874，预测MACE发生的AUC分别为0.772，0.821，0.754，0.882。详见表7及图1、图2。

表7 miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A预测冠心病、MACE发生的价值

图1 miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A预测冠心病发生的ROC曲线图

图2 miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A预测MACE发生的ROC曲线图

3 讨 论

动脉粥样硬化是冠心病的发病基础，其病理机制复杂多样，多认为与炎症反应、脂质沉积于血管内膜、内皮细胞受损、单核细胞/巨噬细胞蓄积及增殖等因素相关[11-12]。随着病人病情加重，血管腔不断狭窄至阻塞，心肌细胞因缺氧、缺血而出现坏死情况，甚至诱发心源性死亡、严重心律失常、病变血管再狭窄等MACE，不利于病人预后[13]。因此，准确评估冠心病病人疾病严重程度、寻找早期标志物对于指导治疗、预防MACE具有重要意义。

miRNA作为一种易感基因，其能够通过结合目标mRNA的3′-UTR区来诱导目标mRNA的降解，调节靶基因蛋白以及mRNA表达，进而参与细胞血管的生成、分化以及凋亡。miR-342-5p是miR-342家族成员，其参与了结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发病过程。Natarelli等[14]研究发现，长期锻炼的人动脉血管会分泌miR-342-5p并运送至心脏，保护心肌细胞，进而预防心肌梗死发生。Wei等[15]研究报道，miR-342-5p通过抑制Akt1与miR-155依赖途径而增强巨噬细胞的炎症刺激，促进动脉粥样硬化。本研究结果显示，病例组miR-342-5p高于健康组，MACE组miR-342-5p高于非MACE组，提示miR-342-5p可能参与冠心病的发生、发病过程，可作为预后的评估指标，分析原因可能在于miR-342-5p可促进炎性因子分泌及调控脂质的摄入，其水平升高时可加重炎症反应及脂质紊乱程度，增加炎性因子的分泌，从而诱发冠心病；miR-342-5p可通过激活机体氧化应激反应，参与核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的传导过程，从而诱发心肌缺血再灌注造成的神经损伤；此外，miR-342-5p可通过抑制c-Jun氨基末端激酶2(c-Jun N-terminal kinase，JNK2)及Caspase-9蛋白表达而抑制细胞增殖，加速心肌凋亡，进而导致心肌梗死[16]。炎症反应在冠心病发病机制中尤为关键，而白细胞跨内皮细胞迁移(TEM)是炎症反应的关键。目前，关于TEM参与冠心病发病中的炎症反应已被证实，但临床上仍缺少关于其参与动脉粥样硬化的相关信号通路研究。细丝蛋白-A可介导多种细胞活动，在细胞内信号传导、肿瘤发生过程中发挥重要作用。国外研究发现，细丝蛋白-A参与炎症反应中内皮细胞迁移，其过表达可抑制TEM[17]。本研究中，病例组病人血清细丝蛋白-A水平比健康组高，与高贝贝等[18]的研究结果相似。血清细丝蛋白-A与Gensini评分、斑块稳定性、炎性因子水平均呈正相关，进一步证实血清细丝蛋白-A与冠心病病情、预后有关，但其作用机制需进一步阐明。

LTBP-2作为转化生长因子-β(TGF-β)的受体，其不仅能够调节TGF-β表达，稳定细胞外基质，影响成纤维细胞的数量，其还与肿瘤进展、恶性程度、肿瘤分期、肿瘤直径等病理特征参数密切相关[19]。但目前关于LTBP-2在心血管疾病中的研究报道较少见。白媛媛等[20]研究显示，转化生长因子-β1(TGF-β1)可经磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路提升心肌细胞中LTBP-2表达，且LTBP-2诊断心力衰竭的作用与N-末端脑钠肽前体相似。本研究发现，LTBP-2表达与冠心病发生、炎症反应、斑块稳定性及预后有关，可能原因与LTBP-2通过影响心肌重构、心肌纤维化等因素而导致病情进展相关。ROC曲线分析发现，miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A预测冠心病病人MACE发生的AUC分别为0.772，0.821，0.754，最佳截断值分别为0.31、22.02 μg/L、53.95 ng/mL，而三者联合检测的AUC最高，为0.882，说明miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A三者联合可有效评估冠心病病人预后，降低漏诊率。

综上所述，miR-342-5p、LTBP-2、细丝蛋白-A在冠心病中呈高表达，与病人病情严重程度、斑块稳定性及炎症反应密切相关，且三者联合有助于预测冠心病及MACE的发生。