瓣膜性心脏病继发心房颤动病人TGF-β1/JNK-MAPK及ERK-MAPK信号通路蛋白表达与T淋巴细胞亚型的相关性

杨 龙，刘春明，王正飞，崔 聪

瓣膜性心脏病属于我国常见心脏病类型之一，以风湿热引起的瓣膜损害最常见，可引起各瓣膜的单独和(或)联合损害，也是导致心力衰竭的主要病因[1]。流行病学数据显示，瓣膜性心脏病继发心房颤动的发生率较高，为30%～65%，在心房颤动的发生原因中瓣膜性心脏病占15%～43%[2]。心房结构重构和心房间质纤维化是心房颤动发生的重要病理机制[3]。转化生长因子-β1(TGF-β1)是最强效致纤维化因子，也是最强的细胞外基质沉积促进剂，其信号通路包括经典Smads系统和非Smads系统两种，且各型Smad分子之间相互协调，在心房颤动、心房纤维化的发生与维持中发挥重要作用[4-5]。TGF-β1能激活下游c-Jun氨基端激酶(JNK)-有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)-MAPK信号通路，进而引起心肌组织的胶原堆积，与心房颤动的发生和维持存在紧密联系[6-7]。此外，细胞免疫在风湿热/瓣膜性心脏病的发生以及诱导心房颤动形成过程中也扮演重要角色[8]。活化的T淋巴细胞能通过“分子拟态”识别脏组织蛋白，在心脏局部和循环炎性因子的诱导下大量聚集，进而释放多种活性细胞因子，维持免疫激活和抑制的平衡状态[9]。其中，尤以CD4+和CD8+T亚型的淋巴细胞，通过交叉反应识别心肌和瓣膜上的配体蛋白或相关信号通路[10]。虽然T淋巴细胞分泌的TGF-β1在早期胚胎发育、胞外基质合成、JNK-MAPK和ERK-MAPK信号通路的活化过程具有重要作用，但CD4+和CD8+T亚型淋巴细胞分泌的TGF-β1是否与瓣膜性心脏病继发心房颤动的发病有关联尚缺乏相关报道。本研究主要探讨心脏组织TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路活化在瓣膜性心脏病继发心房颤动发生中的作用，分析其与T淋巴细胞亚型表达的相关性，以期为该疾病的早期诊断和靶标探索提供相关参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年5月—2020年1月郑州市第七人民医院收治的瓣膜性心脏病病人149例，其中继发心房颤动78例，根据是否继发心房颤动分为心房颤动组、无心房颤动组。心房颤动组78例，男43例，女35例；年龄28～58(41.39±7.24)岁；病程1～7(3.23±1.51)年；主动脉瓣置换术32例，二尖瓣置换术20例，三尖瓣置换术18例，二尖瓣联合主动脉瓣置换术8例；入院时发病时间30～120(85.2±16.9)min；心室率120～180(155.6±15.8)次/min。无心房颤动组71例，男43例，女28例；年龄29～61(42.06±7.31)岁；病程1～8(3.31±1.56)年；主动脉瓣置换术26例，二尖瓣置换术22例，三尖瓣置换术15例，二尖瓣联合主动脉瓣置换术8例。两组病人性别、年龄、病程和手术类型比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：①年龄>18岁；②符合瓣膜性心脏病和心房颤动的诊断标准；③拟行手术治疗，术中取病灶组织，病人可耐受；④术后康复出院，签署知情同意书，临床资料完整。排除标准：①其他类型心脏疾病，如冠心病、心力衰竭、主动脉夹层、急性心包炎、先天性心脏病(如法洛四联症)等；②原发性心房颤动，或者不满足手术指征；③严重血液疾病、严重肝肾功能障碍、恶性肿瘤、近期大手术、放疗、化疗；④严重感染、自身免疫性疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 标本采集 术中取右房壁组织(组织量控制在100 mg)，将脂肪组织去除后置于液氮中，并放置在-80 ℃冰箱中备用，提取蛋白；术中取右房内血液约5 mL进行抗凝血处理，用于T淋巴细胞检测。

1.3.2 主要仪器与设备 蛋白电泳仪、转膜槽、蛋白电泳槽购自美国Bio-Rad公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，Image-Pro Plus 图像分析软件购自美国Media Cybernetics公司。

1.3.3 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测方法 采用Western Blot法测定JNK、ERK、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化ERK(p-ERK)和TGF-β1蛋白水平。常规方法制备分离胶和10%浓缩胶，取一定量蛋白样品，与等体积2×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液充分缓和，100 ℃变性5 min，根据电泳每道50～100 μg加到聚丙烯酰胺凝胶中，设定电压60 V使蛋白脱离浓缩胶，120 V电泳至溴酚蓝达到凝胶底层。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电转液，并转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，室温下采用5%脱脂牛奶封闭2 h；向溶液中加入各目标蛋白一抗(稀释浓度为1∶200，美国Sigma公司)培养过夜，加入对应蛋白二抗，连续孵育2 h。采用增强化学发光检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)进行可视化印迹，Tanon 5200仪器曝光；将最终处理的PVDF膜根据正确位置、方法放置在发光板上，加入少许发光液，选择合适曝光条件，完成显影和保存。

1.3.4 流式细胞仪测定 采用流式细胞仪(赛默飞Attune NxT)测定右房血液中T淋巴细胞亚型(包括CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平)，参照仪器和试剂说明书进行。

2 结 果

2.1 两组TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路蛋白表达比较 心房颤动组心肌组织p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平均明显高于无心房颤动组，差异均有统计学意义(P<0.01)，两组JNK和ERK蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图1。

与无心房颤动组比较，＊P<0.01。图1 两组TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路蛋白表达比较 (A为两组相关蛋白表达电泳图；B为两组相关蛋白表达柱状图)

2.2 两组T淋巴细胞亚型表达比较 心房颤动组右房血液中CD4+和CD4+/CD8+T细胞水平低于无心房颤动组(P<0.05)，但两组CD8+T细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 两组T淋巴细胞亚型表达比较(±s)

2.3 两组TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK蛋白与T淋巴细胞亚型的相关性 Pearson相关分析结果表明，右房心肌组织p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平与右房血液CD4+/CD8+T细胞水平呈负相关(r值分别为-0.439，-0.453和-0.693，P均<0.001)。

3 讨 论

研究表明，心房结构重构所致的心房颤动常伴有心房间质纤维化形成，而心房间质纤维化的不可逆改变将会增加瓣膜性心脏病的发生率，亦是心房颤动发生中不可或缺的因素[11]。对于瓣膜性心脏病病人常伴有心房肌结构的重构，能影响心房局部兴奋或冲动的传导，改变心房电活动并降低传导速度，促进折返环的产生与维持[12-13]。

本研究探讨瓣膜性心脏病继发心房颤动发生与心房肌组织TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路激活的关系，发现心房颤动组心肌组织p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平均明显高于无心房颤动组(P<0.01)，说明TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路在瓣膜性心脏病继发心房颤动病人中表达升高，能促进心脏纤维化的发生。TGF-β1是一种强效致纤维化因子，主要由细胞分泌产生，亦是临床发现最强的细胞外基质沉积促进剂。研究表明，TGF-β1始动与触发心房颤动能引起左心房压力增高，引起心房牵张，并进一步刺激TGF-β1过表达，加剧心房局部纤维化，从而促进瓣膜性心脏病以及继发心房颤动的发生[14]。既往研究表明，TGF-β1主要存在两种信号通路，以转化生长因子-β(TGF-β)/Smads为主，具有良好的生物学作用，亦可与其他信号转导分子相互作用，激活相关蛋白，发挥重要的致纤维化作用[15-17]。

本研究结果显示，心房颤动组右房血液中CD4+和CD4+/CD8+水平低于无心房颤动组(P<0.05)。说明瓣膜性心脏病继发心房颤动病人常伴有T淋巴细胞亚型表达异常，尤其是CD4+/CD8+，可能与TGF-β1调节有关，但是具体机制并未阐明。研究表明，T淋巴细胞是维持风湿热后瓣膜心脏病持续损害的主要参与者之一，T淋巴细胞能够识别致病链球菌M蛋白和心脏组织自身抗原，发挥自身免疫反应，引起瓣膜组织损伤，亦可分泌多种细胞因子进一步发挥生物学作用[18]。T淋巴细胞除了正常分泌Th1、Th2类细胞因子外，亦可分泌TGF-β1。TGF-β1是一类多肽信号分子，在人体中主要由淋巴细胞、心肌细胞、巨噬细胞等分泌，能介导细胞增殖与凋亡，调节细胞外基质作用[19]。激活的T细胞能合成和分泌TGF-β1，作为效应细胞因子。MAPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，包括ERK、JNK和p38，对胞外刺激具有有丝分裂原、胞内应激反应等功能。MAPK在瓣膜性心脏病中能调节多种功能基因表达，影响炎症反应、T淋巴细胞介导的细胞免疫等生理和病理过程。

Pearson相关分析显示，p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平与CD4+/CD8+水平呈负相关(P<0.001)。说明瓣膜性心脏病继发心房颤动病人中TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路与T淋巴细胞之间存在紧密联系，加强病人TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路和T细胞免疫功能检查，有利于指导临床治疗[20]。

综上所述，TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路激活可能参与了瓣膜性心脏病继发心房颤动的发生机制，并与局部血液中CD4+/CD8+T淋巴细胞水平降低有关。研究不足是未设立阴性对照组，不能说明TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路异常激活是否在瓣膜性心脏病的发生中发挥重要作用；未对心房颤动类型进一步区分比较，不能说明TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路异常激活与不同类型心房颤动(阵发性、持续性以及永久性)间的差异性；也未对手术治疗心房颤动后的结局进行描述(恢复窦性心律)，TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信号通路是否恢复窦性心律有关。因此，后续研究应着重关注这些因素。