一种以羊肝为原料的宠物诱食剂发酵工艺研究

孙 蓓，金 杰，刘晓娟，肖欣欣，李 晴，朱中原，王利斌，王龙刚，王维婷，*

（1.江苏省徐州医药高等职业学校，江苏徐州 221116；2.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室，山东济南 250100；3.江苏联益生物科技有限公司，江苏淮安 211700）

近年来，随着经济的持续发展，人们生活节奏不断加快，家庭及人际关系日益疏远，宠物在家庭生活中的地位越来越高，成为许多人的精神寄托。宠物行业因此也得到迅速扩张，据互联网宠物行业各细分市场收入统计，宠物食品收入占比39.3%，是宠物行业的主要部分（吴孝杰等，2019）。

目前按照形态宠物食品可分为干型（干物质80%～90%）、湿型（干物质15%～40%）、半干型（干物质50%）3种类型。国内半干型宠物食品多数以屠宰下脚料为基础原料，调整pH后经热处理制成，与国外发酵类半干型产品相比，技术含量低，竞争力差。张建斌等（2015）利用鲶鱼鱼骨为主要原料，鸡肝为辅料，采用酶解、美拉德反应和发酵等方式，获得了较好的发酵效果。虽然国内目前的肉制品发酵已被广泛应用并带来各种优点（吴丽红和贺稚非，2005），但与之类似可以用于指导企业生产的关于发酵类宠物食品的产品和技术方面的研发鲜有报道，因此，有必要开展相关研究，以提升行业及企业竞争力。

羊肝含有丰富的维生素，如维生素A、B族维生素，是一种营养丰富的动物源性食品原料（姚碧霞等，2008；杨月欣，2005；FrΦslie，1983）。与其他动物肝脏相较，羊肝中的铁、铜和γ-亚麻酸含量更高（Bah，2015）。

本团队前期经选育、培养得到了一种以肝脏为底物的可调节宠物肠道菌群的复合发酵菌种，在本研究中以冷冻羊肝脏为基础原料，对其发酵工艺进行优化，希望能为宠物发酵系列产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 冷冻羊肝：购自济南市惠民广场马家牛羊肉店；复合菌种：乳酸菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、酵母菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、土豆淀粉（食品级）：甘肃正阳现代农业附有有限公司；乳糖（食品级）：河南春祥化工产品有限公司；白糖（食品级）：河北省邢台市隆尧县东方食品城；鸡油（食品）：山东顶嘉油脂有限公司。

1.2 仪器与设备 pH计（FE28）：梅特勒-托利多仪器有限公司；电子分析天平（BSA124S-CW）：斯多利斯科学仪器（北京）有限公司；可调高速匀浆机（FSH-2）：常州市伟嘉仪器制造有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DH6-92435-III）：上海新苗实业有限公司；色差色差计（CR-400）：柯尼卡美能达（中国）投资有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理 100 g羊肝泥与鸡油、蔗糖乳糖混合糖粉、土豆淀粉混匀后高温高压灭菌处理15 min，随后接种复合菌，37℃条件下发酵7 d。发酵完成后，测定发酵物pH、发酵损失，并对发酵产物进行气味、色泽的感官评价，并进行综合评分。

单因素试验分析了鸡油、混合糖粉、发酵底物湿度（土豆淀粉添加量）对发酵结果的影响，从中筛选出参数进行响应面分析，并根据结果完成验证试验。

糖粉总添加量为7 g，响应面分析中计算比例为乳糖：蔗糖（m：m）：1：6记为0.14，2：5记为 0.28，3.5：3.5记 为 0.5，5：2记 为 0.71，6：1记为0.85。

1.3.2 pH值的测定 准确称取10 g样品于烧杯中，加入100 mL氯化钾溶液，12000 rpm匀浆60 s，把匀浆完的溶液用保鲜膜封住，静置30 min，打开保鲜膜，充分摇匀。校准pH计后测定溶液pH，重复3次并记录数据，分别测量发酵物发酵前后的pH。

1.3.3 发酵损失计算 发酵损失计算公式如下：

发酵损失 /%=（m1-m2）/m1×100 ；

式中：m1代表发酵前发酵物质量，g；m2代表发酵后发酵物质量。

1.3.4 发酵效果评分计算 色泽分：发酵产物颜色以褐色为主，发酵产物颜色有金褐色、褐色、棕红色、深褐色、土色等颜色，以深褐色得分最高，土色、棕红色次之，其次褐色、金褐色。

pH：以pH=5.0为满分，±0.01则减1分。

气味：以有肉香最佳，酱香其次、酸香次之，有土豆淀粉生粉味道者最差。

综合上述评分，按照以下公式计算加权得分：

发酵产物综合得分=色泽×0.1+气味×0.2+pH得分×0.1+发酵损失×0.6

1.4 单因素试验

1.4.1 湿度对发酵结果的影响 在100 g羊肝泥中添加混合糖粉7 g：乳糖：蔗糖（W：W）2：5，鸡油16 g，用土豆淀粉调整肝泥湿度分别为20%、30%、40%、50%、60%，发酵后计算发酵产物的综合得分。

1.4.2 混合糖粉的比例对发酵结果的影响 在100 g羊肝泥中分别添加不同比例混合糖分7 g：乳糖 ：蔗糖（m ：m）1：6、2：5、3.5：3.5、5：2、6：1，鸡油16 g，用土豆淀粉调整肝泥湿度30%，发酵后计算发酵产物的综合得分。

1.4.3 鸡油添加量对发酵结果的影响 在100 g羊肝泥中添加混合糖粉7 g：乳糖：蔗糖（W：W）2 ：5，鸡油添加量分别为 0、8、16、24、32 g，用土豆淀粉调整肝泥湿度30%，发酵后计算发酵产物的综合得分。

1.5 响应面试验设计 根据单因素试验的结果，以发酵产物综合得分为指标，设计响应面试验，建立3因素3水平Box-Behnken中心组合实验（Huang，2011），数据用 Design-Expert软件统计，各因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平表

2 结果与分析

宠物食品的pH适当偏酸有助于宠物形成酸性尿液，有利于抑制细菌的滋生（张松山等，2009；冯秀娟等，2008），但酸性过强会影响适口性。在本研究结合前期动物采食试验结果及后续加工需要，选取pH=5.0为最佳发酵底物pH标准，结合发酵损失、发酵产物质构变化及气味等指标，综合分析了发酵底物湿度（土豆淀粉添加量）、混合糖分、鸡油对发酵结果的影响。

2.1 羊肝发酵工艺单因素试验

2.1.1 湿度对发酵结果的影响 由表2可知，发酵过程中，发酵底物中大分子量的营养物质会被分解为更易消化吸收的小分子，同时也会产生独特的风味（曹朝辉，2016），但此过程中，有机化合物会被分解为有机酸、二氧化碳和水分，从而造成发酵损失，增加了生产成本，因此，发酵损失也是企业生产工艺筛选的一个非常重要的指标。随着发酵底物湿度的增加，肉香味随湿度增加而更加浓郁，但发酵损失、pH、发酵物颜色粘聚性呈先上升后下降的趋势。湿度20%～30%时发酵综合得分较高。

表2 湿度对发酵结果的影响

2.1.2 混合糖粉比例对发酵结果的影响 由表3可知，随着乳糖添加量的增加，发酵损失出现了不规律的波动，说明碳源比例对发酵菌种的发酵效率有一定影响。pH总体呈先下降后上升的趋势，颜色随着蔗糖添加量的减少而逐渐加深，同时，发酵产物中的酸香味减轻并消失，肉香味和酱香味开始增加。在微生物发酵过程中，菌种生长的主要碳源来自各种糖，主要为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖，乳糖等（周传云等，2004；张弘等，1992），本试验选取了购买方便且成本低廉的蔗糖和乳糖作为原料糖。因此，在碳源选择上，应着重考虑其对发酵产物风味的影响，其次是发酵损失。

表3 糖粉比例对发酵结果的影响

2.1.3 鸡油添加量对发酵结果的影响 由表4可知，鸡油添加量对发酵产物颜色及流变学特性影响不大，但随着鸡油的添加可以减少发酵损失，并对发酵产物的风味产生明显影响，随着鸡油添加量的增加，肉香味明显增加，这是因为向产品中添加适量脂肪，有利于改善产品的质地、口感及色泽，而鸡油成本低廉、便于购买，是一种常见的原料脂肪。

表4 鸡油添加量对发酵结果的影响

2.2 响应面法优化发酵工艺

2.2.1 响应面法优化试验结果 用Design-Expert 8.05b软件对响应面试验结果进行回归分析，得到发酵产物综合评分（Y）对自变量发酵底物湿度（A）、鸡油添加量（B）、混合糖粉比例（C）的二次回归模拟方程：

Y=63.39+0.41A+1.45B+19.60C+0.01AB+0.02AC-0.06BC-8.86E-003A2-0.04B2-16.83C2

对该回归模拟方程进行方差分析和差异显著性检验，结果见表6。

由表5可知，该模型具有显著性（P＜0.05），模型失拟项0.8894＞0.05不显著，模型的调整确定系数（R2adj）为0.9237，可解释92.37%响应值的变化，相关系数（R2）为 0.9666，与 R2adj较接近，表明此模型拟合程度较好，误差不大，故可用此模型对羊肝发酵工艺结果进行分析与预测。在总的作用因素中，除去B、AC、BC所有项均对结果有显著影响。

表5 回归系数模型及方差分析

2.2.2 响应面结果分析与优化 由图1～图3可以看出回归方程预测4个因素对发酵产物综合评分的影响：由图1可知，随着鸡油添加量的增加，发酵产物综和评分呈现先上升后下降的趋势，发酵底物湿度与鸡油添加量之间有明显交互作用。鸡油添加量及发酵底物湿度的加大在发酵过程中为发酵产物提供了更佳的风味，但会对产品色泽及凝聚性产生不利影响，影响了综合得分，发酵湿度的增加会使发酵损失增加，鸡油添加量的适当增加能对这一缺憾进行弥补。

图1 发酵底物湿度和鸡油添加量交互作用对发酵产物综合评分的影响

由图2可知，混合糖粉比例和底物湿度影响对综合评分的交互作用明显，体现在适当增加糖粉中乳糖含量能减少发酵底物湿度增加所带来的发酵损失，同时减轻了发酵产物中酸、苦等不良风味的产生。

图2 发酵底物湿度和混合糖粉比例交互作用对发酵产物综合评分的影响

由图3可知，鸡油与糖粉比例对综合评分的交互作用主要体现在对整个发酵产物色泽的改良上。鸡油是风味产生的一个重要因素，但其添加量的增加降低了发酵物的色泽吸引度，而适当增加糖粉中乳糖的添加比例能起到一定的补偿效果。

图3 鸡油添加量和混合糖粉比例对发酵产物综合评分的响应面分析

2.3 最佳工艺参数确定及验证性试验 在本试验选取的因素范围内，通过Design Expert软件回归模型分析得出，最优的发酵工艺条件为发酵底物湿度43.09%，鸡油添加量24.22 g，混合糖粉比例乳糖：蔗糖（m：m）为3.15：3.85。在该条件下模型预测发酵产物综合评分能达到96.71分。为便于实际操作，将各因素参数确定如下：发酵底物湿度43%，鸡油添加量24 g，乳糖：蔗糖（m：m）3.2：3.8。

为了验证模型结果，用确定的参数进行了3次发酵试验，发酵综合得分平均为（97.01±0.23），与预测值基本一致，证明了该方程与实际情况拟合度佳，响应面分析法可以应用于羊肝泥发酵工艺参数的优化筛选。

3 结论

羊肝中含有丰富的维生素和微量元素，但因其膻味重及羊副产物综合开发利用不足等原因，造成了大量的资源浪费，本研究开发了一种羊肝泥发酵工艺，通过响应面法优化的最佳发酵工艺参数为：每百克羊肝泥用土豆淀粉调整发酵底物湿度43%，添加鸡油24 g，同时将7 g混合糖粉比例控制为乳糖：蔗糖（m：m）3.2：3.8。该参数下发酵羊肝泥产品的综合评分可达到97分，能较好的控制发酵损失，并在产品色泽和风味上起到很好的诱食效果。