催化剂对凯氏定氮法测定苜蓿青贮中粗蛋白质含量的影响

刘瑞芳，张志远，陈 球，王艺伟，苏利红

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

粗蛋白质是饲料中最重要的营养物质，其含量直接影响动物的生长速度、新陈代谢、繁殖发育和生产性能。饲料中蛋白质含量是评定饲料营养价值的重要指标之一（伊丽君和孙强，2020）。因此，快速、准确测定饲料中粗蛋白质含量，在生产实践中具有重要意义（于菲等，2019；丁进海，2015；朱宇旌等，2011）。饲料中粗蛋白质检测的方法有多种，常用的是国标测定法——凯氏定氮法。凯氏定氮法测定粗蛋白质的过程包括消化、蒸馏、吸收和滴定4个环节，消化是影响蛋白质测定效率和成败的关键（蓝亿阳等，2019；刘庆等，2015）。国标法用硫酸铜和硫酸钾作催化剂进行消化，因其使用量较大易造成消化液冷却后出现大量结晶而影响后续的测定，同时消化时间较长（张泽泉等，2017；曲玲等2015）。在确保测定结果准确性的前提下，如何缩短检测时间、降低试验成本、提高试验效率是饲料粗蛋白质测定需要改进的首要问题。本试验通过研究添加硒粉的混合催化剂对饲料粗蛋白质含量测定的影响，旨在筛选最佳的组合水平。

1 材料

1.1 试验材料 玉米青贮由西北农林科技大学实验教学基地提供。采用四分法将试样缩减至1 kg，65℃烘箱烘干、粉碎、过40目筛，制成的风干样装于密闭容器备用。

1.2 试剂及配制方法

1.2.1 主要试剂 硫酸铜·5H2O、硫酸钾（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、碳酸钠（分析纯）、硼酸（分析纯）、硒粉（分析纯），购于天津市科密欧化学试剂有限公司；甲基红（分析纯）、溴甲酚绿（分析纯），购于国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（98%，分析纯），浓盐酸（分析纯），购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2.2 试剂配制

（1）40% NaOH溶液：准确称取400 g氢氧化钠（分析纯），用蒸馏水溶解，定容至1000 mL。

（2）混合指示剂：准确称取0.1 g甲基红，用无水乙醇将其溶解，定容至100 mL，制成甲基红0.1%的乙醇溶液；准确称取0.5 g溴甲酚绿，用无水乙醇将其溶解，定容至100 mL，制成溴甲酚绿0.5%的乙醇溶液；然后将两者等体积混合，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱保存备用。

（3）2%硼酸溶液：准确称取20 g硼酸（分析纯），用蒸馏水将其溶解，定容至1000 mL。

（4）0.1 mol/L盐酸标准溶液：用移液管准确移取8.3 mL浓盐酸（分析纯），缓慢注入蒸馏水中，摇匀，定容至1000 mL，然后用碳酸钠标定后备用。

1.3 主要仪器 半自动凯氏定氮仪（型号为KDNAA），由上海新嘉电子科技有限公司生产；消化炉（型号为AED-AV），由北京博瑞赛仪器有限公司生产；鼓风干燥箱（型号为DHG-9123），由湖南湘仪仪器有限公司生产；粉碎机（型号为FW-500D），由天津鑫博得仪器有限公司生产；分析天平（型号为ATY220），由日本岛津有限公司生产。

2 方法

2.1 单因素试验

2.1.1 硒粉用量对粗蛋白质含量的影响 用分析天平准确称取试样1.0 g（精确至0.0002 g），小心无损地将试样放入干净的消化管底部（每个水平称取5个平行样），然后加入0.2 g硫酸铜·5H2O，1.0 g硫酸钾和不同量的硒粉（0.05、0.10、0.15、0.2、0.3、0.4g），使其与试样均匀混合。再向消化管中缓慢加入12 mL浓硫酸，然后置于420℃的消化炉上消化2 h，待消化管中液体彻底透明清亮结束消化。将碱管和水管分别插入装有40%氢氧化钠溶液和蒸馏水的桶中，设定加碱量为5 mL和蒸馏时间为6 min，打开冷凝水和电源，对凯氏定氮仪管路清洗3～5次后，将消化管置于凯氏定氮仪，同时用装有20 mL 2%硼酸和2滴混合指示剂的三角瓶吸收氨气。蒸馏结束后，立即用0.1 mol/L盐酸标准溶液滴定吸收液，当溶液由蓝绿色变成灰红色为滴定终点，记录盐酸用量。

2.1.2 硫酸铜用量对粗蛋白质含量的影响 准确称取试样1.0 g（精确至0.0002 g），小心无损地将试样放入干净的消化管底部（每个水平称取5个平行样），然后加入1.0 g硫酸钾、硒粉（2.1.1筛选的最佳量）、不同量的硫酸铜·5H2O（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4 g），使其与试样均匀混合，后续测定步骤同上。

2.1.3 硫酸钾用量对粗蛋白质含量的影响 准确称取试样1.0 g（精确至0.0002 g），小心无损地将试样放入干净的消化管底部（每个水平称取5个平行样），然后加入硒粉（2.2.1筛选的最佳量）、硫酸铜·5H2O（2.1.2筛选的最佳量）和硫酸钾（2、2.5、3、3.5、4、5 g），使其与试样均匀混合，后续测定步骤同上。

2.2 正交试验

在结合上述单因素试验结果的基础上，对影响粗蛋白质含量的催化剂（硒粉、硫酸铜和硫酸钾）用量进行三因素三水平正交实验（如表1）。

表1 正交设计试验的处理因素及水平 g

2.3 空白测定 准确称取0.5 g蔗糖代替试样，按上述步骤进行空白测定，消耗0.1 mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2 mL。

2.4 改进法和国标法对粗蛋白质含量测定的比较 准确称取试样1.0 g（精确至0.0002 g），每种方法称取5个平行样，改进法称取硒粉0.2 g、硫酸铜0.2 g、硫酸钾3 g作催化剂；国标法称取硫酸铜0.4 g、硫酸钾6 g作催化剂。两种方法硫酸用量、消化温度和消化时间均相同且同上，后续方法和测定步骤同上。

2.5 结果计算

CP/%=c×（V1－ V2）×0.014×F/M×100。

式中：c为盐酸标准溶液的物质的量浓度，mol/L；V1为滴定试样时所需的标准盐酸溶液体积，mL；V2为滴定空白时所需的标准盐酸溶液体积，mL；0.014为1 mL的1 mol/L盐酸相当的氮的质量；M为样品的质量，g；CP为粗蛋白质含量。

F为氮转换成蛋白质的系数（取均值6.25）。

2.6 数据统计 硒粉、硫酸铜和硫酸钾最适添加量试验用单因素方差分析。在单因素方差分析中用Duncan’s法对不同添加量组间均数进行多重比较。3种催化剂和3种添加剂量正交实验数据用双因素方差分析检验催化剂和添加量组合间差异，筛选3种催化剂最佳剂量组合。用SAS 21.0软件中ANOVA过程执行单因素和双因素方差分析，主效应和多重比较显著水平为P＜0.05，结果以“均值±标准差”表示。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 硒粉用量对粗蛋白质含量的影响 由表2可知，随着硒粉用量的增加，粗蛋白质含量呈先升高后降低的趋势。其中处理4所测玉米青贮的粗蛋白质含量最高，显著高于处理1和处理2（P＜0.05），与其他处理差异不显著（P＞0.05）。从结果分析可知，可能由于处理1和处理2的硒粉用量偏少，样品消化不彻底，从而导致测定的粗蛋白质含量偏低。处理5和处理6所测粗蛋白质含量低于处理3和处理4，可能由于硒粉用量过多导致氮的损失所致，该结果与陆晓滨等（2003）、杨文华（2017）的报道结果一致。试验结果表明，硒粉的最佳用量为0.2 g。

表2 硒粉用量对粗蛋白质含量的影响

3.1.2 硫酸铜用量对粗蛋白质含量的影响 由表3可知，处理2～6中所测粗蛋白质含量高于处理1，但差异不显著（P＞0.05）。处理2～6中，随着硫酸铜用量的增加，粗蛋白质含量无明显变化，但消化管中出现结晶的现象明显增多，特别是处理5和处理6，消化管中的结晶片为后续测定带来影响。试验结果表明，过量使用硫酸铜不影响粗蛋白质的含量，但影响消化液的结晶状况。该结论与颜常盛（2020）、李敏等（2015）、张生辉（2009）的研究结果一致。综合试样蛋白质含量和消化管中结晶的程度来考虑，添加0.2 g硫酸铜为宜。

表3 硫酸铜用量对粗蛋白质含量的影响

3.1.3 硫酸钾用量对粗蛋白质含量的影响 硫酸钾在消化粗蛋白质的过程中可提高浓硫酸沸点，加快有机物分解（梁世岳等，2019）。不同量的硫酸钾对粗蛋白质含量的影响如表4所示，处理2～6测得的粗蛋白质含量均高于处理1，其中处理3显著高于处理1（P＜0.05），其他处理与处理1差异不显著（P＞0.05）。随着硫酸钾用量的增多，处理4～6中所测粗蛋白质含量低于处理3，但差异不显著（P＞0.05）。可能由于过量使用硫酸钾，引起消化液温度太高而导致氮的损失。国标法测定粗蛋白质时，硫酸钾用量为6 g（王志刚等，2017）。该试验结果表明，在最佳硒粉和硫酸铜用量的作用下，硫酸钾的用量明显减少，其最佳使用量为3 g。

表4 硫酸钾用量对粗蛋白质含量的影响

3.2 正交试验 在单因素试验的基础上，对硒粉、硫酸铜、硫酸钾用量进行3因素3水平的正交试验，进一步优化凯氏定氮法测定粗蛋白质含量的最佳催化条件。从表5的试验结果看出，混合催化剂的3个组分对粗蛋白质含量的影响顺序依次为硒粉＞硫酸钾＞硫酸铜，这与（李敏等，2015；陆晓滨等，2003）的研究报道一致，硒粉可加速消化反应的速度及硫酸钾在消化粗蛋白质过程中所起作用大于硫酸铜。试验结果表明，催化剂的最佳组合为A2B1C2，即硒粉0.2 g、硫酸铜0.2 g、硫酸钾 3.0 g。

表5 正交试验及结果分析

3.3 改进法和国标法对粗蛋白质含量测定的比较 由表6可知，两种方法对粗蛋白质测定的结果无明显影响，但改进法的相对标准偏差明显低于国标法。国标法使用0.4 g硫酸铜和6 g硫酸钾作为催化剂。而改进法在混合催化剂中添加0.2 g硒粉后，硫酸铜和硫酸钾的用量明显减少，且消化管中无结晶现象。

表6 改进法和国标法对粗蛋白质含量测定的比较

4 结论

在国标法测定粗蛋白质采用硫酸钾和硫酸铜作混合催化剂的基础上添加高效催化且抑泡的硒粉。通过单一变量试验和正交试验研究改进法混合催化剂（硒粉+硫酸铜+硫酸钾）最佳用量组合，筛选的混合催化剂（0.2 g硒粉+0.2 g硫酸铜+3.0 g硫酸钾）测定效果较理想，这为建立高效催化和快速消化测定粗蛋白质的模式开拓了新途径。