电针天枢、大肠俞对慢传输型便秘大鼠结肠组织ChAT、SCF和c-Kit表达的影响

钟峰，匡泓俊，文钱，曹洋，袁楠，杨腊媛，袁杨阳，章薇

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007

慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是以结肠传输时间延迟为特征的肠道疾病，好发于青年女性和老年群体。STC发病率逐年提高，全球患病率达14%。此外，STC缠绵难愈、反复发作，降低患者生活质量，部分患者通过服用泻药改善症状，但长期服用泻药会导致肾病、心脑血管疾病患病风险增加。

STC发病机制尚未明晰，目前认为肠神经系统、Cajal间质细胞（ICC）是治疗STC的关键靶点。酪氨酸激酶受体c-Kit能与干细胞因子（SCF）结合，形成SCF/c-Kit 通路，调控ICC 增殖。乙酰胆碱转移酶（ChAT）是胆碱能神经元的标志酶，是肠神经系统的重要组成部分。本团队前期研究发现，电针“天枢”“大肠俞”能改善胶质细胞源性神经营养因子甲基化状态，缓解便秘症状。俞募配穴是针灸基础理论最经典的配穴法，大肠俞和天枢分别为大肠俞募穴，被广泛用于治疗消化系统疾病。但电针天枢、大肠俞能否通过调节ChAT、SCF、c-Kit表达发挥促进肠动力作用并不清楚。本实验通过建立STC大鼠模型，观察电针天枢、大肠俞对结肠组织ChAT和SCF/c-Kit通路表达的影响，明确电针治疗STC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，5～6 周龄，体质量（180±20）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0003。饲养于湖南中医药大学动物实验中心，温度20～25 ℃、湿度40%～60%环境，标准饲料喂养。实验过程遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。本实验方案通过湖南中医药大学动物伦理委员会审批（LL2021091502）。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol（美国Invitrogen 公司，货号15596018），RIPA 裂解液（北京百奥莱博公司，货号MT0066），PVDF 膜（美国Millipore 公司，货号IPVH00010），SCF抗体（美国GeneTex公司，货号31379），c-Kit抗体（美国ThermoFisher 公司，货号14-1172-82），ChAT抗体（英国Abcam公司，货号ab178850），复方地芬诺酯片（江苏常州康普药业，批号1503030）。HANS-200A型电针仪（苏州医疗用品厂有限公司），华佗牌针灸针，0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品有限公司，MDF-C8V 超低温冰箱（日本Sanyo 公司），SJX-402，高温杀菌恒温箱（上海跃进），CFX96型RTPCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 分组与造模

将复方地芬诺酯片与生理盐水混合，制成浓度为15 mg/mL地芬诺酯混悬液。将40只大鼠随机分为空白组、盐水组、模型组和电针组，每组10只。模型组和电针组参照文献[7]采用复方地芬诺酯混悬液灌胃建立STC大鼠模型，体积10 mL/kg，空白组不予处理，盐水组灌胃等体积生理盐水，连续21 d。末次灌胃后，大鼠禁食不禁水24 h，予150 g/L活性炭混悬液灌胃，体积1 mL/100 g。第22日记录首粒黑便排出时间，排出时间长于空白组均值的大鼠为造模成功。盐水组用于验证生理盐水对结果的影响。

1.4 干预

造模成功后，剔除电针组大鼠腹部和背部毛发，碘伏消毒。参照《实验针灸学》，选取双侧“天枢”“大肠俞”直刺进针5 mm，各穴旁开0.5 mm处刺入一辅助针用于固定，浅刺透皮。主针与辅助针分别接电针仪正、负极，疏密波，频率2/15 Hz，强度0.5～1 mA，以肢体末端轻微抖动为度，15 min/次，1次/日，空白组、盐水组和模型组每日固定15 min。连续14 d。

1.5 胃排空率和小肠推进率检测

干预结束后，大鼠禁食不禁水24 h，予半固体糊（含活性炭、淀粉、糖、羧甲基纤维素钠、奶粉等）1 mL（质量为W1）灌胃，30 min后腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠，剖腹，结扎贲门和幽门，取出胃和小肠，将小肠拉直，用卷尺测量幽门至半固体糊推进处的距离（L1）及幽门到回盲部长度（L2），称量胃总质量（W2），剪开胃体，冲洗内容物，称量胃净质量（W3），计算胃排空率和小肠推进率。胃排空率（%）＝[1－（W2－W3）/W1]×100%，小肠推进率（%）＝L1/L2×100%。

1.6 免疫荧光检测

大鼠结肠组织用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片。切片二甲苯脱蜡，过氧化氢灭活内源性酶，PBS浸泡，热修复法修复抗原，滴加山羊血清室温封闭30 min，分别加入ChAT、c-Ki t一抗（均为1∶100），4 ℃孵育过夜。加入荧光二抗（1∶200），37 ℃避光孵育30 min，DAPI避光孵育5 min，抗荧光衰减剂封片。激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，每张切片随机选取3个视野拍照。ChAT标记胆碱能神经元，阳性表达为红色，c-Kit标记ICC，阳性表达为绿色。Image J 1.8.0软件计算平均荧光强度。

1.7 Western blot检测

取结肠组织，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。上样，电泳，蛋白转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入c-Kit、SCF一抗（均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次。加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，PBST洗膜3次。加入ECL化学发光液显色曝光，采用Image J 1.8.0软件分析条带灰度值。以β-tubulin为内参，计算蛋白相对表达量。

1.8 RT-PCR检测

取结肠组织，加入1 mLTrizol研磨，加入氯仿振荡15 s，室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，转移水相，按RNA提取试剂盒说明书提取RNA。将RNA反转录成cDNA，进行PCR。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、50 s，共40个循环。以β-actin为内参，用2法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 电针对模型大鼠胃排空率和小肠推进率的影响

空白组与盐水组大鼠胃排空率、小肠推进率差异无统计学意义（＞0.05）；与空白组比较，模型组大鼠胃排空率、小肠推进率显著降低（＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠胃排空率、小肠推进率显著升高（＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠胃排空率和小肠推进率比较（，%）

2.2 电针对模型大鼠结肠组织乙酰胆碱转移酶和酪氨酸激酶受体c-Kit表达的影响

空白组与盐水组大鼠结肠组织ChAT和c-Kit表达差异无统计学意义（＞0.05）；与空白组比较，模型组大鼠结肠组织ChAT和c-Kit表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠结肠组织ChAT和c-Kit表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01）。见图1、图2、表3。

表3 各组大鼠结肠组织ChAT和c-Kit表达比较（，荧光强度）

图1 各组大鼠结肠组织ChAT阳性表达（免疫荧光染色）

图2 各组大鼠结肠组织c-Kit阳性表达（免疫荧光染色）

2.3 电针对模型大鼠结肠组织干细胞因子和酪氨酸激酶受体c-Kit蛋白表达的影响

空白组与盐水组大鼠结肠组织SCF和c-Kit蛋白差异无统计学意义（＞0.05）；与空白组比较，模型组大鼠结肠组织SCF和c-Kit蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠结肠组织SCF和c-Kit蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01）。见图3、表4。

表4 各组大鼠结肠组织SCF和c-Kit蛋白表达比较（）

图3 各组大鼠结肠组织SCF、c-Kit蛋白免疫印迹

2.4 电针对模型大鼠结肠组织干细胞因子和酪氨酸激酶受体c-Kit mRNA表达的影响

空白组与盐水组大鼠结肠组织SCF和c-Kit mRNA差异无统计学意义（＞0.05）；与空白组比较，模型组大鼠结肠组织SCF和c-Kit mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠结肠组织SCF和c-Kit mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01）。见表5。

表5 各组大鼠结肠组织SCF和c-Kit mRNA表达比较（）

3 讨论

STC属中医学“便秘”范畴，病机以大肠传导失职为主，涉及脾、肾、肝等脏腑。病机可概括为情志失衡致气机滞留、饮食失洁致湿热阴寒积于胃肠、年老劳倦致气血两虚不濡胃肠等。五脏六腑之气汇聚于俞募穴，天枢归胃经，为大肠之募穴。《灵枢·本输》有“大肠小肠，皆属于胃，是足阳明也”，故论治肠病可从胃经出发。刺激天枢可补益脾胃、益精养血，气血充盈推动有力，从而促进胃肠传导。从解剖学上分析，天枢深部为小肠，深刺天枢可调节肠功能，且安全性较高。大肠俞是大肠之背俞穴，属膀胱经，可调节肠道传导。两穴相配，共奏疏通肠腑气机之效。团队前期临床研究表明，电针天枢、大肠俞对功能性肠病有双向调节作用。基础研究表明，电针“天枢”“大肠俞”能减轻STC大鼠结肠损伤，修复ICC结构。

肠神经系统-ICC-平滑肌网络构成胃肠道动力的基本单位。胆碱能神经元是一种广泛分布的神经系统神经元，在肠神经系统中含量最高。ChAT在胆碱能神经元胞体中合成，能催化合成促进胃肠动力激素乙酰胆碱。胆碱能神经元的数量及其合成的ChAT与肠动力密切相关。ChAT是胆碱能神经元的标记物，通过检测ChAT能反映结肠胆碱能神经元的数量及活性。研究表明，胆碱能神经元数量减少，结肠ChAT表达降低，肠道神经肌肉传递减少，释放促肠动力激素不足，则导致肠动力下降。ICC是一种广泛存在于平滑肌组织的间质细胞，特别是胃肠道中存在大量ICC，其能激发慢波电位，与肠道平滑肌细胞相互作用，是胃肠动力的起搏细胞。c-Kit是存在于ICC表面的受体之一，能反映ICC的数量和活性，其能与SCF通过细胞外结构域结合，形成SCF/c-Kit信号通路，通过活化酪氨酸激酶，在调控细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥关键作用。研究表明，SCF/c-Kit信号通路的抑制与STC发病密切相关。

本实验结果显示，模型组大鼠胃排空率和小肠推进率下降，结肠组织ChAT、SCF、c-Kit 表达显著降低，提示结肠组织ChAT表达和SCF/c-Kit信号通路与STC发生有关。电针“天枢”“大肠俞”干预后，大鼠胃排空率和小肠推进率明显恢复，结肠组织ChAT、SCF、c-Kit表达显著升高，表明电针可促进ChAT表达，恢复胆碱能神经元功能，激活SCF/c-Kit信号通路，从而改善胃肠道传输功能。

综上所述，电针天枢、大肠俞可能通过促进ChAT表达、激活SCF/c-Kit 信号通路，恢复肠神经系统-ICC-平滑肌网络结构，从而发挥治疗便秘作用。