氮磷添加对羊草-土壤-根际微生物化学计量特征的影响

郑斯元，王英逵，刘鞠善，李 杰，王德利

(东北师范大学草地科学研究所，植被生态科学教育部重点实验室，吉林 长春 130024)

生态化学计量学(Ecological stoichiometry)是目前生态学关注的重要理论之一，该理论认为，有机体所需要的影响生态系统的生产力、营养循环和食物网动态的多种元素(主要是C，N，P)之间处于多重平衡.这一理论也适用于研究生态系统内不同结构层次的养分循环[1].生态化学计量学主要基于动态平衡的原理，即当外界环境的变化在一定限度内时，有机体能保持自身的化学计量处于相对稳定之中，并与环境中的化学计量元素保持相对平衡状态.C，N，P是维持和完成生物有机体生命活动的主要元素，同时也是影响生态系统生产力的重要元素[1].C，N，P 含量及化学计量特征可以用来研究植物各器官的元素分配，确定植物-土壤-微生物等不同生态系统组分之间的养分循环关系.

生态系统的地上和地下部分是紧密相连的，它们之间的互相作用可以极大影响生态系统的过程和性质[2].土壤 C，N，P 含量及化学计量关系可直接反映土壤肥力情况，也间接表明了植物的营养状况[3].植物与土壤之间的养分迁移则是通过微生物以及它们所产生的有机物分解酶来介导的.研究发现，在半干旱草原，不同功能群植物与其根际土壤的化学计量之间存在显著相关性，但与其根际微生物化学计量之间的相关性较弱[4]；桉树(Eucalyptusrobusta)和两种林下植物的N/P与土壤的N/P均密切相关[2]，且土壤 C/N/P的化学计量比显著影响植被的C，N，P含量及生态化学计量变化[5]；在撂荒以及种植柠条(Caraganakorshinskii)和刺槐(Robiniapseudoacacia)的3种土地利用方式下，植物细根与微生物C/N/P化学计量比的变化方向一致(尤其N/P的变化)[6].这些研究结果表明，植物、土壤和微生物的C/N/P化学计量特征之间存在一定的相关性，且存在强弱区别.植物根际的生长情况可以直接影响土壤中微生物的生物量、群落结构以及土壤的养分特征[7].根际内的植物-微生物养分反馈也会通过养分的矿化和固持来影响土壤化学计量特征[8].根际微生态系统理论(Rhizosphere micro-ecosystem theory)将生态系统的概念导入到根际中，以植物-土壤-微生物作为研究对象，既可将其视作一个统一且特殊的整体来研究不同组分之间的关系，也可独立研究其中每一组分的特征[9].因此，根际不仅是生态系统地上、地下组成部分之间进行养分和能量交换的重要界面，也是一个特殊的生态系统.

N和P是草地关键的限制性营养元素，大气氮沉降和施肥等自然和人为形式的N输入会改变草地的N和P循环过程，从而对草地中各生物与非生物组分的N和P含量及其化学计量特征产生影响.N添加可以通过增加土壤N的利用率来减轻N限制，从而刺激植物、微生物的生长发育，提高植物群落生物量和微生物活性，改变植物-土壤-微生物之间的养分分配关系[10].但是，直接添加无机N也会使植物和微生物对养分产生强烈竞争，从而导致劣势竞争者的化学计量失衡并受到土壤中养分的限制[10].此外，N沉降还会影响植物体内P的吸收、转化和储存过程，从而将植物受到的N限制转变为P限制[11].与N不同，植物无法从大气中获得P，但人类活动(如施P肥等)可对P循环产生一定的干扰[12].虽然迄今已有大量关于N和P添加对草地化学计量特征影响的研究，但关于根际微生态系统中各组分C，N，P含量的变化及限制机制的研究仍然较少.为此，本研究以松嫩草地的建群种与优势种羊草(Leymuschinensis)作为研究对象，从生态化学计量的角度，探讨了N和P添加条件下羊草根际微生态系统中关键养分元素(C，N，P)的变化、权衡与联系，以更深入地阐释植物和微生物的养分限制机制以及地上-地下生物互作的复杂性，并为根际微生态系统理论在化学计量方面的研究提供有效的参考.

1 研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于吉林省长岭县境内的东北师范大学松嫩草地生态研究站(北纬44°45′、东经123°45′).该区域位于欧亚大陆草原带东缘，气候属于典型的温带大陆性气候，年平均气温4.9 ℃～6.7 ℃；年均降水量280～400 mm，其中约70%集中在植物生长季(6—8月)；年均蒸发量1 500～2 000 mm，远高于降水量.区域主要土壤类型为盐碱化草甸土(pH=7.5～10.0).

1.2 实验材料与设计

本实验采用的植物材料为羊草.羊草为欧亚大陆东部草原上的建群种和优势种，也是优良牧草之一，具有抗干旱、抗寒冷、耐盐碱的能力，具有重要的生产与生态利用价值[13].2018年6月，选取饱满的羊草种子，用75%的酒精消毒后播种到育苗盘中萌发.待羊草幼苗长出，选取大小一致的幼苗(株高(10±0.5)cm)移栽至花盆中(盆内径32 cm，高20.9 cm)，以供实验之用.

本研究采用盆栽实验，实验设计为完全随机设计.实验共设置4种处理方式：对照(CK)，N添加(+N)，P添加(+P)以及N和P共同添加(N+P).根据松嫩草地生态研究站自2009年设置的长期N添加实验平台[14]，本实验N添加量为10 g/(m2·a)，以硝酸铵(NH4NO3)的形式添加；P添加量为5 g/(m2·a)，以磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2)的形式添加.每个处理有8个重复，共计32盆.在每盆中种植12株羊草幼苗，盆内装土10 kg.待幼苗长势稳定后，进行养分添加.养分添加分3次进行(1次/周)，每次添加总施用量的1/3.实验用土为草甸土，土壤pH=7.68，电导率为268.80 μs/cm，总C含量为7.68 mg/g，总N含量为0.64 mg/g，总P含量为0.12 mg/g.将本实验盆栽统一放置于野外温室中，以避免自然降水对实验的干扰.

1.3 样品采集与分析测定

2018年8月末，对羊草进行破坏性取样，取每个盆栽中羊草的地上叶片和地下根系部分.取羊草根系时，取摇动主干后仍附着在根部的土壤作为根际土壤，保存在4 ℃的冰箱内，用于土壤和根际微生物指标的测定.将羊草叶片、根系部分置于信封内放入烘箱，105 ℃杀青30 min后放于65 ℃烘箱内烘干(72 h)至恒重.烘干的羊草样品使用球磨仪磨至粉末状后，利用稳定同位素质谱仪(Isoprime 100)测定叶、根的总C、总N含量，利用全自动间断分析仪(Smartchem 450型)测定总P含量.取部分根际土壤样品自然风干，用0.15 mm细筛过滤后，利用总有机碳分析仪(Elementar Vario)、凯氏定氮仪(Kjeltec 8400)、全自动间断分析仪分别测定土壤的总C含量、总N含量、总P含量.取新鲜根际土壤样品，采用氯仿熏蒸法测定羊草根际微生物总生物量.利用总有机碳分析仪、凯式定氮仪和分光光度计(UV-2201)分别测定微生物生物量中C，N，P的含量.

1.4 数据处理

首先采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验+N、+P及N+P添加处理对羊草根、土壤及根际微生物C，N，P含量及化学计量比特征的影响，若方差不齐则采用非参数检验方法.然后采用Turkey’s多重比较分析4种处理下植物、土壤和根际微生物C，N，P含量及其化学计量学特征的差异.采用Person相关分析方法分析4种处理下羊草与土壤之间、土壤与根际微生物之间以及羊草与根际微生物之间的C，N，P含量及化学计量特征的内在联系.使用CANOCO(Version 5.0)平台对羊草根、叶、根际微生物与土壤因子，根、叶与根际微生物因子进行冗余分析(RDA)排序，并绘制二维排序图.所有检验显著性水平为P<0.05.统计分析利用SPSS 23.0软件完成.

2 结果与分析

2.1 土壤有机碳含量、N含量、P含量及其生态化学计量比特征

N和P的添加对土壤养分及化学计量比的影响不同(见图1).+N处理下土壤有机碳含量(SOC)显著增加14.24%，而+P以及N+P处理对SOC无显著影响.+N处理下土壤N含量显著增加12.86%，而+P以及N+P处理对土壤N含量无显著影响.+P以及N+P处理均显著增加了土壤的P含量(分别增加100.35%和119.10%)，其中N+P处理下土壤P含量增加最多.+N、+P及N+P处理对土壤C/N均无显著影响；+N、+P及N+P处理显著降低了土壤的N/P(分别降低24.06%，52.76%和54.59%)，其中+P及N+P处理土壤N/P下降最多；+P及N+P处理显著降低了土壤的C/P(分别降低53.54%和53.83%).

不同小写字母表示不同处理下土壤C，N，P含量及C/N、N/P、C/P差异显著(P<0.05)，下同

2.2 羊草根、叶的C，N，P含量及其生态化学计量比

羊草根、叶的C，N，P含量及化学计量比对N和P添加的响应存在差异(见图2).+N、+P及N+P处理对根的C含量均无显著影响，但在+N及N+P处理下，羊草叶的C含量显著增加2.12%和3.48%.+N及N+P处理使根的N含量显著增加81.61%和52.05%，而+P处理则使叶的N含量显著降低30.11%.+P和N+P处理显著增加了叶的P含量(分别增加63.03%和46.09%)，而+N处理则使叶的P含量显著下降了45.15%.根的P含量仅在+P处理下增加66.06%.+N处理未显著改变叶的C/N，但使根的C/N显著降低47.20%.+N处理使叶、根的N/P均显著增加(分别增加111.09%和106.35%).+N处理使叶的C/P显著增加91.38%.在+P处理下，叶的C/N显著增加42.99%，叶、根的N/P和C/P均显著降低(叶分别降低57.01%和38.53%，根分别降低42.77%，33.80%).N+P处理对叶的C/N、N/P、C/P均无显著影响，仅显著降低了根的C/N和C/P(分别降低36.54%和31.45%).

图2 N和P添加处理下羊草叶、根的C，N，P含量及其生态化学计量比特征

2.3 根际微生物C，N，P含量及其生态化学计量比

羊草根际微生物的C，N，P含量及化学计量比在4种处理下的变化均不相同(见图3).由图3可见，+N、+P及N+P处理均显著降低了羊草根际微生物生物量中的C含量(分别降低36.65%，47.05%和28.84%).+N、+P及N+P处理羊草根际微生物的N含量也均显著降低(分别降低21.03%，50.42%和29.57%).+N、+P处理下微生物生物量中的P含量无显著变化，而在N+P处理下微生物的P含量显著增高69.02%.+N、+P及N+P处理下微生物的C/N均无显著变化.+N处理下微生物N/P无显著变化，而C/P显著降低30.93%.在+P处理下，微生物N/P和C/P均显著降低61.43%和60.85%.在N+P处理下，N/P和C/P也均显著降低55.54%和55.70%.

图3 N和P添加处理下根际微生物的C，N，P含量及其生态化学计量比特征

2.4 羊草、土壤及根际微生物养分和化学计量关系

由相关分析结果(见表1)可知，羊草叶、根、土壤和根际微生物的C，N，P含量及化学计量比之间存在一定的相关性(P<0.05).

表1 N和P添加处理下羊草(叶、根)-土壤-根际微生物生物量C，N，P含量及化学计量比的相关关系

续表1

在相关性分析的基础上，以羊草叶、根、根际微生物的C，N，P含量及生态化学计量比为响应变量，以土壤的SOC、N含量、P含量及生态化学计量比为解释变量，进行冗余分析(RDA).结果表明，SOC、N含量、P含量、C/N、N/P、C/P共6个变量可解释羊草叶、根、根际微生物C，N，P含量及生态化学计量比变异的59.47%，54.29%，47.26%.其中，土壤N含量和N/P对羊草叶养分以及化学计量比具有显著影响，且均达到极显著水平(P<0.01)，土壤N含量的作用大于N/P(见图4A、表2).而土壤的N/P和SOC对羊草根养分以及化学计量比具有显著影响，且均达到极显著水平(P<0.01)(见图4B、表2)，土壤N/P的作用大于SOC.土壤C/P和N/P对羊草根际微生物养分及化学计量比具有显著影响，其中土壤C/P达到极显著水平(P<0.01)(见图4C、表2).

A.土壤与羊草叶化学计量特征冗余分析；B.土壤与羊草根化学计量特征冗余分析；C.土壤与根际微生物化学计量特征冗余分析；D.根际微生物与羊草叶化学计量特征冗余分析；E.根际微生物与羊草根化学计量特征冗余分析

以羊草叶、根的C，N，P含量及生态化学计量比为响应变量，以羊草根际微生物的C，N，P含量及生态化学计量比为解释变量，对4种处理下叶、根的C，N，P含量及生态化学计量比进行冗余分析(RDA).结果表明，微生物生物量中的C，N，P含量及C/N、N/P、C/P共6个微生物因子解释了叶、根的C，N，P含量及生态化学计量比变异的52.65%，50.22%.其中，微生物的C/N和P含量对羊草叶养分及化学计量比具有显著影响，微生物C/N达到极显著水平(P<0.01)(见图4D、表2)；微生物的N/P对羊草根养分以及化学计量比具有显著影响，且达到极显著水平(P<0.01)(见图4E、表2).

表2 N和P添加处理下土壤、根际微生物对羊草根、叶C，N，P含量及化学计量比的解释量与显著性检验

3 讨论与分析

3.1 N和P添加处理对土壤SOC、N含量、P含量及其化学计量比的影响

N和P添加处理下，土壤SOC、N含量、P含量均有不同程度的增加，其化学计量比发生了不同程度的变化.+N处理显著增加了土壤SOC和N含量，这是由于短期的N添加可抑制土壤CO2的外流，降低了土壤总呼吸(自养和异养)速率，减少了土壤微生物的生物量和活性[15]，显著增加了土壤SOC；N添加还可促进硝化速率，使土壤中的无机N含量增加[16]，累积更多的养分.+P及N+P处理均会增加土壤P含量，这是由于在土壤中P比N更难溶且不易因淋溶等原因消失，所以更容易在土壤中积累[17].土壤C/N和C/P通常用来表示土壤的矿化能力以及土壤N和P的有效性，本研究中土壤C/P在+P及N+P处理下均显著降低，表明P添加可增加土壤P的可用性，加快有机质分解速率，从而改善土壤的P限制.

3.2 N和P添加处理对羊草叶、根C，N，P含量及其化学计量比的作用

植物可以通过对不同元素的吸收分配进行权衡，从而维持自身C，N，P养分的协调与平衡，同时植物体不同器官的养分含量及化学计量比也能反映植物体的营养吸收和代谢情况.+N及N+P处理下，羊草叶C含量显著增加，因为叶片是植物主要的光合器官，N添加可促进叶片的光合作用速率，同化更多的CO2[18].+N及N+P处理显著增加了根的N含量，由于N的添加增加了植物根部对硝酸盐的利用率，因此更多的N可用于根吸收和细根组织的储备[19].通常将叶N/P作为植物营养限制的标准，因为在养分受限的环境中植物会倾向于分配给叶片更多的养分以满足光合作用所需[20].Koerselman的研究[21]就将叶片N/P作为植物养分的限制标准：N/P<14表明植物受N限制，N/P>16表明植物受P限制，14

3.3 N和P添加处理对羊草根际微生物C，N，P含量及其化学计量比的影响

N和P的添加对羊草根际微生物生物量C，N，P含量及其化学计量比影响各有不同.在草地生态系统中，N是主要的限制性养分，且植物和微生物之间对N的竞争非常激烈[23].与植物相比，微生物的表面积与体积比更大，而且具有生长代谢速率快和N吸收速率高的特点，因此被认为是土壤中N竞争的优势者[24].但本研究发现，在+N、+P及N+P处理下，羊草根际微生物的C和N含量均显著降低，这可能是由于短期内的大量N和P添加使土壤中的C不足以维持微生物快速的初始生长速率，导致其再次受到C而非N和P的限制，造成根际微生物的大量死亡，从而降低了与植物竞争养分的能力，使植物成为养分竞争的优势者.在N+P添加处理下微生物生物量中P含量显著增加，这可能是由于N和P的共同添加促进了根际微生物对于磷酸酶的释放[11]，从而有助于微生物对土壤中P的分解和吸收.微生物生物量C/N/P的化学计量是分解者群落养分需求的基础，一般情况下土壤C/N/P化学计量的变化不会显著影响土壤微生物生物量的C/N/P，微生物C/N/P化学计量处于相对平衡状态(w(C)/w(N)/w(P)=60∶7∶1)[25].但在特定情况下，N和P的添加也可通过资源和微生物生物量之间的化学计量失衡导致特定养分对微生物活性的限制，并摄取土壤中的有机质调节自身的化学计量比[26].本研究发现，仅在+N处理下，微生物生物量C/N/P化学计量比值显著下降，表明在松嫩草地，N的添加更易导致羊草根际微生物化学计量的失衡.

3.4 N和P添加处理下羊草-土壤-根际微生物C/N/P化学计量关系

本文的研究发现，在添加养分的情况下，羊草、土壤和根际微生物的化学计量之间均存在一定的相关性，表明养分的添加会影响根际微生态系统中的养分循环[1].Garnier[27]研究发现，植物中某元素浓度如果与土壤中该元素的浓度呈正相关，则植物受土壤中该元素的限制.本实验中，羊草根N含量与土壤N含量、叶P含量与土壤P含量均呈显著正相关，表明羊草受土壤中N和P的共同限制.土壤N含量和N/P对羊草叶C/N/P化学计量均有极显著的影响.土壤N/P是土壤养分状况的重要指标，进一步表明该研究区羊草生长受到土壤中N和P的共同限制，且受N的限制更强.土壤的N/P和SOC对羊草根的C/N/P也有显著影响.土壤SOC是土壤肥力状况的表示指标[28]，羊草在与根际微生物的养分竞争中，羊草根占据了优势地位，因此土壤SOC含量对羊草根的C/N/P化学计量的影响更大.本研究与Sistla等[29]的研究结果一致，即土壤与微生物生物量化学计量之间具有一定相关性，在添加营养的条件下微生物可通过分解摄取土壤中的有机质来调节自身的化学计量.土壤C/P和N/P对微生物生物量化学计量均有显著影响，尽管养分添加下土壤C，N，P含量均有不同的变化，但P含量的增加比率显著高于C和N的增加比率，从而导致土壤C/P和N/P的显著变化.与细菌相比，真菌对土壤P含量的变化更为敏感，土壤P含量增加可能改变了微生物的群落结构(如真菌/细菌的比率增加)[30]，从而导致真菌占据了竞争优势地位，受到土壤C/P和N/P的影响更多.羊草叶、根的化学计量均与根际微生物的化学计量有一定的相关性，这可能是因为微生物可以产生富含C，N，P和其他营养物质的酶，并根据其相对于资源供应的基本需求来保留或释放养分，从而控制、调节植物可利用的养分[31].微生物生物量的C/N和P含量对叶的影响更大，微生物生物量的N/P对根的影响更大，其中微生物的C/N对叶化学计量的影响主要来源于微生物生物量中的N含量而非C含量的改变(见表1)，所以羊草根、叶的C/N/P化学计量除了受土壤中N和P含量的限制，也会受根际微生物生物量中N和P含量变化的限制[32].结合RDA解释率和相关性分析的结果，发现在根际微生态系统中土壤与羊草之间的相关性比土壤与微生物以及羊草与微生物之间的相关性更强.这可能是由于养分添加破坏了微生物的C/N/P化学计量的平衡，导致微生物受到了C限制，从而在与植物的养分竞争中处于劣势地位，进而与羊草和土壤C/N/P化学计量关系趋于解耦.但与羊草根相比，土壤、根际微生物均与羊草叶化学计量之间的相关性更强，这可能与植物自身的营养分配策略有关，植物叶片进行光合作用需要更多的养分，所以对土壤和微生物中的养分，尤其是N和P含量的依赖性更强.

4 结论

(1) 在+N、+P及N+P处理下，羊草(叶、根)、土壤以及根际微生物的C，N，P含量及比值均产生了不同程度的变化.N的添加增加了土壤SOC和N的含量，P的添加和N与P共同添加增加了土壤P含量.N的添加增加了叶中的C和根中的N含量，降低了叶的P含量；P的添加降低叶N的含量，增加了叶、根的P含量；N和P的共同添加增加了叶中C和P的含量以及根中N的含量.N和P的分别添加及共同添加降低了根际微生物的C和N含量，而N和P的共同添加增加了微生物的P含量.

(2) 羊草生长受到了N和P的共同限制，其中N的限制更强.添加N虽能缓解N限制产生的影响，但会将植物生长所受的限制转变为P限制；而P的添加则会加剧草地受N限制的程度，破坏植物C/N/P化学计量的平衡.

(3) N和P的添加可导致根际微生物的C限制，减少了根际微生物的生物量，从而使根际微生物在与植物的养分竞争中处于劣势地位.

(4) N和P添加条件下的根际微生态系统中，与植物根相比，土壤和根际微生物均与植物叶的化学计量关系更紧密.总体而言，植物和土壤均与微生物之间的化学计量关系趋向于解耦合，由此导致植物-土壤-微生物系统中各组分的C，N，P化学计量失衡，降低了根际微生态系统的稳定性.

本研究也为根际微生态系统理论在化学计量学方面的应用提供了有效参考.