HNO3改性荔枝木生物炭对大豆累积Cu、Ca、As、Cd的影响

唐惠娟，江红樱，李霞，向绍锦，曾庆宇，刘俊,2,3,4,5,*，杨飞，吴顺

1.南华大学衡阳医学院，基础医学院，细胞生物学与遗传学教研室，衡阳 421001

2.南华大学衡阳医学院，基础医学院，生态健康与人类重要疾病防控湖南省高校重点实验室，衡阳 421001

3.南华大学衡阳医学院，基础医学院，有色金属矿区耕地重金属污染生态阻抗技术研究衡阳市重点实验室，衡阳 421001

4.南华大学衡阳医学院，基础医学院，生物毒理与生态修复衡阳市重点实验室，衡阳 421001

5.南华大学衡阳医学院，公共卫生学院，典型环境污染与健康危害湖南省重点实验室，衡阳 421001

6.中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410018

矿产资源的开发和利用在人类社会生产生活中发挥了重要作用，同时也导致了矿区周边的农田土壤重金属污染严重[1-2]。我国耕地重金属污染严重，Cd、Ni、Cu、Zn、Hg和As是主要的污染元素[3]。洞庭湖湿地周围土壤表层中As和Cd的浓度均超过《土壤环境质量标准》(GB 15618—2018)中农用地土壤筛选值，近年Cd的浓度处于持续增长状态[4]。Ca为植物的必需元素之一，有适量的Ca可减轻Cd、Pb和Zn等重金属对植株的毒害作用[5]。重金属在土壤中不能被微生物分解，可长期存在于土壤中，并通过食物链的富集作用严重危害人类健康[6]。因此重金属污染土壤的修复与利用是人类可持续发展中的重要课题。植物修复技术可原位减小或消除重金属对农作物的危害，且不会导致二次污染的发生。从常规作物中筛选出可适用于不同土壤条件且能大面积种植的修复品种已成为一种趋势[7]。

大豆具有生长迅速、高产稳产、可吸收累积重金属等特点，在世界各地广泛种植，因此其重金属污染问题严重影响人类社会的食品安全[8-9]。适合在矿区生长的植物主要为草本植物，草本植物具有强的吸收土壤水分和肥料的能力，这有利于草本植株吸收重金属[10]。大豆也属于草本植物，其根系对土壤中的矿质元素具有较强的吸收能力。有研究表明，生物炭能促进大豆的生长以及对镉的富集能力[11]。

我国有大面积的荔枝果园，每年果农疏剪的荔枝树枝大量被废弃，或者被直接焚烧，造成大量的资源浪费和环境污染。如何合理开发、利用废弃的荔枝树枝，以减少碳排放，成了一个重要的科学问题。生物炭是一些生物质资源通过高温裂解所形成的富碳材料，在结构上部分高度芳香化，具有丰富的羧基等含氧官能团，有着极好的吸附性能[12]，能够加强土壤的保水保肥能力[13]，被作为土壤改良剂广泛应用于修复受污染的土壤[14]。有研究表明，生物炭经过生物、物理或化学改性后，在利用效能、修复重金属污染土壤性能等方面有提高[15]。利用硫酸、磷酸、草酸和硝酸等对生物炭进行改性处理后，生物炭中的酸性官能团数目有所提高，且其比表面积也有不同程度的改变[16-17]。Wibowo等[18]利用HNO3对生物炭进行改性后，生物炭表面的酸性官能团数目显著增加且比表面积增大。

迄今为止，未见有关经HNO3改性生物炭对大豆累积与分配Cu、Ca、As和Cd影响的研究。本项目通过盆栽试验，研究了向重金属污染土壤添加HNO3改性的荔枝木生物炭后，大豆生物量、植株及器官累积Cu、Ca、As和Cd的变化，探讨了HNO3改性生物炭对大豆累积与分配Cu、Ca、As和Cd的影响，以期为重金属污染土壤的修复和大豆食品安全提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

供试大豆品种为兴隆一号，种子由湖南省农业科学院提供。供试生物炭原材料为荔枝木，供试土壤取自衡阳市雨母山乡稻田土壤。供试土壤重金属Cu、Ca、As和Cd的含量分别为16.188、1 680.525、6.855和0.310 mg·kg-1。

1.2 生物炭的制备及HNO3改性处理

用去离子水将荔枝木洗净，在80 ℃烘干12 h。然后将荔枝木切成5 cm长的切片，放入坩埚，在马弗炉中500 ℃炭化6 h。待自然冷却至25 ℃，将它通过一个0.28 mm的筛子。最后用去离子水冲洗至中性pH值，制得荔枝木生物炭(BC)。

将浓硝酸优级纯(9.07×10-5mg·L-1)稀释至1.26×10-5mg·L-1，按每100 g生物炭添加1 L 1.26×10-5mg·L-1HNO3，然后在30 ℃下振荡8 h，用自来水和去离子水漂洗，最后干燥，制备成HNO3改性荔枝生物炭(HNO3-BC)，将制成的HNO3改性荔枝木生物炭样品保存于干燥器中。

1.3 盆栽试验

供试土壤自然风干、锤碎、过5 mm筛，保存备用。按每kg土加0.10 g N、0.15 g P2O5、0.10 g K2O计算，以尿素、磷酸二氢铵和氯化钾为肥源，溶于水后混匀等量喷洒在土壤中拌匀后装盆。每盆装风干土4 kg，HNO3改性生物炭添加量为0.125%、0.250%、0.500%和1.000%(改性生物炭在土壤中的质量占比)；以不添加HNO3改性生物炭为对照。每处理重复3次。选取籽粒饱满的种子，0.5%次氯酸钠浸泡消毒30 min，用去离子水冲洗。将冲洗后的种子播于盆栽土壤中，每盆4粒种子。

盆栽不定期浇灌蒸馏水，以保持土壤持水量在70%左右，且需定期除草等。在大豆植株表现为两叶一心时，各盆保留长势相近的2棵健壮植株，待大豆成熟，收获成熟大豆植株地上部分和地下部分。

1.4 测定项目与方法

将收获的大豆植株分为根、茎、叶、籽粒和豆荚5个部分，先后用自来水和去离子水洗净，置于105 ℃烘箱内杀青1 h，再调至80 ℃烘至恒重。称量每株大豆各器官的生物量(干质量)后，使用非金属器械将烘干的植物样品粉碎、混匀后分别装入密封袋保存。植株各部位重金属含量采用HNO3-HClO4体系消化[19]。供试土壤重金属含量采用HNO3-HCl-HClO3消解[20]。

消解液中Cu浓度用火焰原子吸收光谱法测定，As采用原子荧光光谱仪测定，Ca和Cd浓度用原子吸收分光光度法测定[21-22]。各元素含量测定过程以国家标准物质土壤和植物进行质量控制，Cu、Ca、As和Cd这几个元素的回收率在97.1%～103.0%范围内，符合元素分析质量控制标准。

1.5 数据处理及分析

大豆植株重金属总量的计算公式：植株重金属总量=根生物量×根重金属浓度+茎生物量×茎重金属浓度+叶生物量×叶重金属浓度+豆荚生物量× 豆荚重金属浓度+籽粒生物量×籽粒重金属浓度。大豆植株生物量=根生物量+茎生物量+叶生物量+豆荚生物量+籽粒生物量。

采用Excel 2016和SPSS 16.0软件进行统计分析，实验数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果(Results)

2.1 HNO3改性荔枝木生物炭表面结构变化

由图1可知，改性前，BC表面呈蜂窝状，窝孔结构较多、长度不一，表面灰分较少。改性后的HNO3-BC表面孔网结构更加规整，呈更加清晰的长条状凹槽结构；同时表面微孔结构增多，孔内有较多微小颗粒堆积。

图1 荔枝木生物炭(BC)的扫描电镜图注：(a) BC；(b) HNO3-BC。Fig.1 SEM analysis of lychee biochar (BC)Note:(a) BC;(b) HNO3-BC.

2.2 HNO3改性生物炭对大豆植株和大豆籽粒生物量的影响

由图2可知，向重金属污染土壤施加HNO3改性生物炭对大豆植株的生物量影响显著(P<0.05)。在一定生物炭施用范围内，随着HNO3改性生物炭施用量的增加，大豆植株生物量明显降低，但达到一定施用量时大豆植株的生物量显著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量为0.500%时，大豆植株的生物量达到最低值，比对照组降低了9.140%；在HNO3改性生物炭施用量为1.000%时，大豆植株的生物量达到最大值，比对照组增加了5.376%。由图2可知，向复合重金属污染土壤施加HNO3改性生物炭后，大豆籽粒的生物量显著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量为1.000%时，大豆籽粒的生物量达到最大值，与对照组相比增加了25.000%。

图2 HNO3改性生物炭对大豆植株和大豆籽粒生物量的影响注：不同小写字母表示不同生物炭用量间差异显著(P<0.05)。Fig.2 Effect of HNO3 modified biochar on the biomass of soybean plant and soybean seedsNote:The different lowercase letters indicate significant difference among different biochar dosage (P<0.05).

2.3 HNO3改性生物炭对大豆植株累积重金属总量的影响

由表1可知，向重金属污染土壤中施加HNO3改性生物炭后，大豆植株累积Cu、As、Cd和Ca的总量显著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量为0.125%时，大豆植株累积的As总量达到最大值，比对照组增加了47.059%；在HNO3改性生物炭施用量为0.250%时，大豆植株累积的Cu和Cd总量达到最大值，分别比对照组增加了25.506%和44.048%；在HNO3改性生物炭施用量为1.000%时，大豆植株累积的Ca总量达到最大值，比对照组增加了65.778%。

表1 施用HNO3改性生物炭对大豆植株累积重金属总量的影响Table 1 Effect of applying HNO3 modified biochar on the total heavy metals accumulated in soybean plants

2.4 HNO3改性生物炭对大豆植株各器官累积重金属的影响

2.4.1 大豆植株各部位Cu含量

由表2可知，向重金属污染土壤施用HNO3改性生物炭后，大豆植株根、豆荚和籽粒中Cu含量显著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量为0.250%时，大豆植株根、豆荚和籽粒中的Cu含量达到最大值，比对照组分别增加了174.777%、46.518%和33.574%。HNO3改性生物炭施用量为0.500%时，大豆植株茎和叶中的Cu含量达到最大值，比对照组分别增加了18.693%和22.882%。

2.4.2 大豆植株各部位As含量

由表2可知，向重金属污染土壤施用HNO3改性生物炭后，大豆植株根、茎、豆荚和籽粒中As的含量显著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量为1.000%时，大豆植株根、茎和籽粒中的As含量达到最大值，比对照组分别增加了88.870%、11.111%和23.611%。在HNO3改性生物炭施用量为0.125%时，大豆植株豆荚中As含量达到最大值，比对照组增加了42.424%。

2.4.3 大豆植株各部位Cd含量

由表2可知，向重金属污染土壤施用HNO3改性生物炭后，对大豆植株各器官中Cd的含量影响显著(P<0.05)。大豆植株根和豆荚中Cd含量较对照组显著增加，分别在施用量为0.250%、1.000%时达到最大值，比对照组分别增加了176.002%、28.732%。在施用量为0.125%时，大豆植株茎和叶中Cd含量显著降低(P<0.05)；随着施用量的增加，茎和叶中Cd的含量显著增加(P<0.05)，分别在施用量为0.500%、1.000%时达到最大值，比对照组分别增加了8.141%、59.407%。施加HNO3改性生物炭后，大豆植株籽粒中Cd的含量显著降低，在施用量为1.000%时，籽粒中Cd的含量达到最小值，比对照组降低了69.620%。

2.4.4 大豆植株各部位Ca含量

由表2可知，向重金属污染土壤施用HNO3改性生物炭后，大豆植株各器官Ca的含量显著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量为0.125%时，大豆根中Ca含量达到最大值，比对照组增加了100.706%。在HNO3改性生物炭施用量为1.000%时，大豆茎、叶、豆荚和籽粒中Ca含量达到最大值，比对照组分别增加了30.995%、72.871%、33.853%和20.093%。

表2 施用HNO3改性生物炭对大豆植株各器官重金属含量的影响Table 2 Effect of applying HNO3 modified biochar on the accumulated heavy metals in the organs of soybean plants

3 讨论(Discussion)

3.1 HNO3改性生物炭对大豆植株生长的影响

As-Cd复合污染对大豆植株的生长具有抑制作用，且As-Cd复合污染比单元素As污染对大豆植株生长的抑制作用更强[23]。Cu是植物生长必需的微量元素，但是植物组织中过量的Cu会产生毒害作用，如降低植物的光合作用及对矿物质元素的吸收能力等[24]。Ca能促进大豆植株某些酶的活化，改善大豆根瘤的固氮能力，从而促进大豆植株的生长发育[25]。有研究表明，Ca能有效缓解重金属对植物的毒害作用[26-27]，氯化钙的施加可促进大豆的生长[28]。有研究发现，向土壤中施用100 t·hm-2的生物炭，并配施氮肥，可使萝卜的干物质质量增加95%～266%[29]。在不同类型和不同利用方式的土壤中添加生物炭后，土壤中pH增加、有机碳、全氮和速效钾等含量均显著提高[30-33]。施用生物炭可改善土壤板结、通气性和含水率等，其中含水率随生物炭施用量的增加而增加[34-35]。

研究表明，重金属在植物体内的累积会影响植株生物量的增长及其在各器官中的分配格局[36-37]。在本研究中，HNO3改性生物炭的施用促进了大豆植株对Cu、Ca、As和Cd的吸收，因此大豆植株会受到Cu、As和Cd的毒害作用；同时HNO3改性生物炭对土壤性质的改善可促进大豆植株的生长，大豆植株各器官累积Ca含量的增加可拮抗Cu、As和Cd对大豆植株的毒害作用。本研究结果表明，在低浓度生物炭施用量范围内，HNO3改性生物炭对大豆植株的生长有一定的抑制作用。可能是由于HNO3改性生物炭促进了Cu、As和Cd的累积，Cu、As和Cd对大豆植株的毒害作用占优势，从而抑制了大豆植株的生长；高浓度的HNO3改性生物炭促进了大豆植株的生长，可能由于随着HNO3改性生物炭浓度的增加，大豆植株累积Ca的含量逐渐增加，Ca对大豆植株的解毒作用及土壤理化性质改善促进大豆植株生长协同作用的结果。在本研究中，施用HNO3改性生物炭后，大豆籽粒的生物量显著增加。这可能是由于As、Cd主要分布于大豆植株的营养器官，籽粒中Cd含量显著降低；同时大豆植株各器官Ca含量增加、土壤理化性质改善。因此在低浓度生物炭施用范围内，大豆植株其他各器官的生长受到了Cu、As和Cd抑制，但大豆籽粒的生长受到了促进作用。本研究发现，大豆植株各器官中累积的Cu、Ca、As和Cd等重金属含量随HNO3改性生物炭的施用量不同而改变，进而导致大豆植株各器官的生物量分配格局发生改变；但其机制尚不明确，值得进一步探究。

3.2 HNO3改性生物炭对大豆植株累积重金属的影响

土壤中可经迁移被植物吸收的重金属为有效态重金属，重金属的有效性决定了其在土壤中的毒害作用[38]。土壤pH值是重金属形态和迁移的关键控制因素，有研究表明，土壤中有效态Pb和有效态Cd的含量与有机质含量和pH值存在负相关关系，通过提高土壤的pH值并施用有机钝化剂可有效降低重金属的有效态[39-40]。采用不同的处理方法对生物炭进行处理后，生物炭的各种表面理化性质将发生改变，包括生物炭的表面官能团、表面积和表面电荷等的改变[41-43]。如经酸碱处理、磁化处理等改性处理的生物炭一般其比表面积增大、表面官能团增多，因此其吸附能力得到提高[44]。有学者利用HNO3对松木屑生物炭进行改性处理，经改性后的生物炭比表面积、总孔容积及表面的酸性基团羧基、酚羟基显著增加[45]。杨兰等[46]利用HNO3对油菜秸秆制备的生物炭进行改性，结果表明HNO3改性生物炭可降低土壤中的pH值，提高了土壤中Cd的有效态含量。

本研究中生物炭经HNO3改性后，呈现清晰的条状凹槽结构，微孔结构增多，孔内有较多微小颗粒堆积，使孔隙空间减小，增加了生物炭的比表面积。这是由于HNO3具有强氧化性，生物炭表面发生氧化作用，打通了表面封闭的细小微孔结构，同时使孔壁坍塌成较大孔径[47]。本研究结果表明，向重金属污染土壤中施加HNO3改性生物炭后，大豆植株对Cu、Ca、As和Cd的累积作用均显著提高。这可能是由于经HNO3改性的生物炭比表面积及总孔容积增加，对大豆植株根际周围土壤的持水作用增强，促进了Cu、Ca、As和Cd随着水分向大豆植株的迁移和积累；同时由于HNO3改性的生物炭酸性基团显著增加，施用HNO3改性生物炭降低了土壤中的pH值，增加了土壤中有机质含量，促进重金属在土壤中的水解，大豆根际土壤对Cu、Ca、As和Cd的吸附作用减弱。

3.3 HNO3改性生物炭对大豆植株各器官中重金属含量的影响

由表2可知，Cu在大豆植株中含量分布为根>籽粒>叶>茎>豆荚，As在大豆植株中含量分布为根>叶>豆荚≈茎>籽粒，Cd在大豆植株中含量分布为根>叶>茎>豆荚>籽粒，Ca在大豆植株中的含量分布为叶>茎>豆荚>根>籽粒。由此可见，Cu、As、Cd和Ca在大豆植株各器官的分布具有差异性。重金属在植物中的分布规律一般为地下部分>地上部分，即根>茎叶>籽粒。本研究中Cu在籽粒中的含量高于在茎叶中的含量，有研究表明，大豆豆荚和籽粒中的Cu含量高于茎叶，Cu为植物必需元素之一，易于向籽粒转移[48]，本研究结果与其一致；Ca主要分布在叶中，这是因为Ca参与植物的光合作用、氧化磷酸化，因此Ca易向叶片迁移[49]。

本研究中向土壤施加HNO3改性生物炭，大豆植株对Cu、Ca、As和Cd的累积总量增加。各HNO3改性生物炭施用水平均显著增加了Cu、Ca和As在根、豆荚和籽粒的累积量，且大豆籽粒的生物量明显增加。因此可能是由于籽粒的生长及HNO3改性生物炭促进了大豆植株水分的吸收，从而促进了Cu、Ca和As随着营养物质及水分由根部向籽粒的迁移。大豆植株各器官中根部是大豆植株累积Cd的主要器官，将Cd从根部运往地上部的能力弱[50]。研究表明，大豆植株受到Cd胁迫时，大豆植株可以将吸收的Cd大部分保留在营养器官中，进而减少籽粒中的Cd含量[51]，与本试验研究的结果一致。大豆植株叶片和豆荚对Cd的累积影响Cd在大豆植株其他各器官中的分布，特别是影响Cd在籽粒中的累积[51]。有研究表明，Cd是易溶于水的金属元素，Cd和水分易受水稻叶片蒸腾作用的影响而向叶片转移，生物炭的施用可以加强这一影响[52]。另有研究表明，施用生物炭可以相对增加水稻籽粒Cd库的相对容量，使水稻籽粒的Cd含量降低[53]。本研究中Cd在豆荚、叶片中的含量明显增加，但在籽粒中的含量明显降低。可能是由于HNO3改性生物炭的施用提高了大豆根际土壤的持水率，大豆植株叶片的蒸腾作用增强，从而促进了Cd和水分子向叶片的转移；HNO3改性生物炭还可通过增加大豆籽粒Cd库的相对容量，继而使大豆籽粒Cd含量降低。

3.4 “HNO3改性生物炭+大豆植株”模式修复重金属污染农田的潜力

素有“鱼米之乡”美称的湖南省土壤重金属污染严重，并已影响农产品食品安全与人类健康[4,22]。研究表明，湖南省湘潭市、株洲市和衡阳市等地抽检的稻米Cd、As严重超标[54-55]。因此，有必要对湖南省耕地土壤进行重金属修复和阻控[56]。本研究中，向重金属污染土壤施加HNO3改性生物炭后，大豆植株对Cu、As、Cd和Ca的累积能力明显增强。在HNO3改性生物炭用量为0.25%时，每株大豆可有效去除重金属污染土壤中Cu(0.310 mg)、As(0.020 mg)和Cd(0.121 mg)，按一般农田种植密度，预计种植20万株·hm-2(添加HNO3改性生物炭改良土壤)，可去除重金属污染土壤Cu 62 020 mg、As 3 920 mg和Cd 24 140 mg。HNO3改性生物炭可降低籽粒中Cd含量，增加籽粒中As的含量，同时大豆籽粒的生物量明显增加。参照谷类的标准，籽粒的As与Cd含量均未超出《食品安全国家标准 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)食品安全限量值。Cd在大豆籽粒中主要存在于粗蛋白和淀粉中，只有极少量分布于粗脂肪中，因此可以利用Cd胁迫下生产的大豆籽粒提炼植物油，进一步降低大豆籽粒中Cd的健康风险[57]。近年来，生物能源材料因具有可再生性、安全性好等特点，正在被逐步开发利用[58]，大豆油可作为生物柴油的原料，利用大豆油制备生物柴油的相关研究越来越多[59-61]。因此，HNO3改性生物炭可提高大豆植株修复重金属污染土壤的能力，同时可促进大豆植株可食用部分籽粒的生物量的增长，且大豆籽粒中As与Cd的含量未超出《食品安全国家标准 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)标准中规定的食品限量值。