环境浓度氧化石墨烯和多环芳烃复合暴露诱发成年斑马鱼脑组织的分子响应研究

孙晶，刘玉玮，胡献刚，欧阳少虎,*

1.生态环境部海河流域北海海域生态环境监督管理局生态环境监测与科学研究中心，天津 300061

2.南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室，天津 300071

近年来，随着氧化石墨烯(graphene oxide,GO)研究的增多和产品应用的增长，GO不可避免地释放到环境尤其是水体环境中[1-2]。水中的有机污染物可能被在水环境中稳定存在的碳纳米材料吸附(如GO)后发生转移，从而诱导生物产生更大的毒性效应，或者水体中污染物的化学结构因为与碳纳米材料相互作用发生改变，从而使之毒性变小，即纳米材料与污染物联合毒性可能是协同的、拮抗的或是抑制的[3]。GO可以吸附多种有机污染物，如染料、抗生素、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)和农药等[4-6]。其中，PAHs因其在环境中分布极为广泛，且具有致癌、致畸和致突变等特性受到了人们的极大关注，也是重要的环境和食品污染物[7-8]。有报道指出，近年来我国主要地表水中的PAHs含量在104.78～7 596.56 ng·L-1之间[9-11]，且已有部分地区达到中等或重度污染水平。因而当GO被排放到水体环境中时，将与水体中的PAHs污染物共存，其潜在的复合暴露生态风险不容忽视。

环境中的复合污染造成的毒性评估是生态风险评价中十分重要的一环[12]。近年来针对PAHs与碳纳米材料的复合污染研究时有报道。例如，剥离石墨烯和多壁碳纳米管与PAHs发生相互作用后，碳纳米材料的生物相容性发生了改变，且剥离石墨烯和多壁碳纳米管均可以通过对PAHs的吸附来降低PAHs的生物利用度[13]；然而，也有其他研究指出纳米材料与有机污染物复合后，对生物的联合毒性效应可能表现为协同作用、拮抗作用或没有相互影响[14-15]。然而，目前关于GO和PAHs对斑马鱼成鱼脑组织的复合暴露毒性及其分子效应和机理尚未可知。斑马鱼是一种经典的环境毒理学模式生物，也是研究纳米材料和PAHs的水生态毒性的常用模型[16-17]。CYP1B1和β-半乳糖苷酶与斑马鱼脑组织的代谢和衰老相关，可以反映外源污染对斑马鱼的作用[18-19]，而转录组学是近年来斑马鱼毒理机制研究的重要手段之一[20]。因而，为考察GO与PAHs对水生生物的联合毒性效应，选取环境预测浓度的GO与环境当量浓度PAHs同时暴露成年斑马鱼21 d，对暴露后斑马鱼脑组织的CYP1B1和β-半乳糖苷酶水平及转录组学响应进行研究，从表观到基因层面深入揭示GO和PAHs对成年斑马鱼脑组织联合暴露毒性的分子机理。本文的结果为其他碳纳米材料和其他共存污染物的潜在毒理效应提供技术方法和理论参考数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 GO与PAHs的购置与配制

GO购于南京先丰纳米科技公司(货号XF002-1)，16种优控PAHs购自于美国AccuStandard公司(初始浓度：2 mg·mL-1)。GO和PAHs的相关性质和表征结果详见本课题组之前的工作[21-22]。参考既往研究[20,23-24]，选取0.01 mg·L-1和0.1 mg·L-1为GO在环境中的预测浓度，并将其应用于斑马鱼的暴露；与此同时，参考了近年来我国主要水体PAHs的平均浓度[10-11]，同时考虑到进行低浓度亚急性毒性效应测试(21 d)，选择了较为合适的斑马鱼成鱼的PAHs暴露浓度，为5 μg·L-1。综上，本研究将GO与5 μg·L-1PAHs复合，设定了0.01 mg·L-1GO与5 μg·L-1PAHs复合暴露组(PAHs-GO01)、0.1 mg·L-1GO与5 μg·L-1PAHs(PAHs-GO1)复合暴露组，同时为确认5 μg·L-1PAHs对斑马鱼的毒性效应，设立了5 μg·L-1PAHs暴露组(PAHs)。各实验组设置和名称缩写如表1所示。将成年斑马鱼暴露于空白和污染物溶液中21 d后，收集斑马鱼脑组织进行毒性分析。

表1 毒理实验中PAHs和GO浓度Table 1 Concentrations of PAHs and GO in toxicity test

1.2 斑马鱼饲养与毒性暴露

暴露生物为6～8月龄AB型野生成年斑马鱼，购自中国科学院水生生物研究所斑马鱼资源中心。开始暴露实验前统一将斑马鱼饲养于配备循环水泵的30 L玻璃水箱中，饲养水为60 mg·L-1天然海盐水，水温为(28.0±1.0) ℃。使用商业鱼饲料(中国惠州市寸金饲料有限公司)进行饲养，频率为每天2次，投食量以斑马鱼1 min内吃完为宜。光照程序为10 h黑暗+14 h光照。

开始暴露前，斑马鱼被置于人工气候箱(SPX-300I-C，中国上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)进行环境适应，适应和暴露期间气候箱温度、光照程序和喂食均与未暴露时饲养环境一致。在2周的适应期结束后，每次实验暴露均选取36条健康且体型相近的成年斑马鱼并将其随机地分成6组，每组包含6条斑马鱼，分别按照表1中组别的设置将其分为对照组、GO01组、GO1组、PAHs组、PAHs-GO01组和PAHs-GO1组。对照组和暴露组的斑马鱼均分别置于相应1 L烧杯中进行为期21 d的暴露，斑马鱼暴露液每隔一天更换一次，暴露环境与斑马鱼饲养和适应条件保持一致。为保证后续实验生物重复样品量，本研究中对照组和实验组均设置了3组平行，3组平行同时进行暴露，每组的驯养和暴露条件相同。

暴露实验进行21 d后，使用3%三卡因(纯度99%，美国Sigma公司)处死斑马鱼后，迅速使用冰冷的生理盐水清洗，并将其置于解剖盘上进行解剖，取出斑马鱼脑组织，清洗干净后装入洁净无菌离心管中，置于冰上备用。

1.3 斑马鱼脑β-半乳糖苷酶和氧化代谢酶CYP1B1含量测定

将对照组和暴露组的斑马鱼脑组织转移至1.5 mL离心管中，加入200 μL冰冷的生理盐水，使用匀浆器将组织匀浆2 min，制成斑马鱼脑组织匀浆。将斑马鱼脑组织匀浆使用冷冻离心机(5804 R，德国Eppendorf公司)在4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心5 min，吸取上清备用。斑马鱼脑组织β-半乳糖苷酶和氧化代谢酶CYP1B1的含量使用酶联免疫法(ELISA)试剂盒(中国上海哈灵有限公司)测定。测试过程严格按照试剂盒说明书进行。斑马鱼脑组织匀浆上清蛋白质含量由BCA蛋白试剂盒(中国南京建成有限公司)测定，测定过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 转录组样品测试与结果分析

为探究GO与PAHs对斑马鱼脑组织的作用机理，使用转录组学对其分子机理进行研究。在本研究中，GO有2个浓度，0.01 mg·L-1和0.1 mg·L-1，为获得更好的实验效果，斑马鱼脑组织转录组的样品使用0.1 mg·L-1GO组；同时，为研究PAHs与GO-PAHs复合暴露对斑马鱼脑组织的影响，且为与GO组结果保持一致，因而本研究中转录组测定的浓度组为对照组、GO1组、PAHs组和PAHs-GO1组。获取各浓度组斑马鱼脑组织后，迅速将其置入液氮中进行保存。样品的RNA的提取和检测参考本课题组之前的工作[25]，简要步骤如下。

首先，样品RNA提取使用TRIzol液(美国Invitrogen公司)，采用经典提取法提取样品的总RNA。样品总RNA的纯度和浓度分别使用超微量分光光度计(NP80，德国Implen公司)和Qubit®RNA测定试剂盒(Nano 6000，美国安捷伦公司)进行鉴定和测定；RNA测序前进行文库构建，文库构建完成后，使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2 nmol·L-1)，用以保证文库质量；文库准确定量完成后进行上机测序。

转录组数据分析：得到测序结果后，首先定义差异基因在本研究中，为保证去除测序过程中的假阳性的出现，对差异基因(different expressed genes,DEGs)的筛选标准为：∣Log2(暴露组的基因表达量/对照组基因的表达量)∣≥1，且其检验后的P≤0.0005，分别为上调基因和下调基因。同时，基因的功能分析，即功能富集分析和通路分析，均使用筛选出的DEGs进行分析。

1.5 数据统计分析

所有的实验组均设置3个或3个以上生物重复，结果用平均值±标准偏差表示。所得实验数据使用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差(ANOVA)分析，当P<0.05时，认为在统计学上具有显著性。斑马鱼脑组织功能富集分析以及通路分析数据均源于京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库。对于转录组显著差异通路的定义为：若该通路P<0.05时，则该通路则被认为是显著变化的。数据条形图和线图均使用Origin 8.5绘制。

2 结果(Results)

2.1 斑马鱼暴露期间存活、畸形、CYP1B1酶和β-半乳糖苷酶含量变化

在成年斑马鱼暴露于对照组和暴露组21 d后，结果显示，对照组和所有暴露组均未对成年斑马鱼的存活和畸形造成影响，该结果与已有研究报道结果一致[23-24]，说明在环境预测浓度的GO、5 μg·L-1PAHs及其复合暴露组中亚急性暴露状态下均不会诱发成年斑马鱼的死亡和畸形。与此同时，暴露结束后斑马鱼的脑组织CYP1B1酶和β-半乳糖苷酶含量分别如图1(a)和1(b)所示。相比于对照组，暴露组出现了下降趋势，且GO1组和PAHs-GO1组CYP1B1含量显著下降(P<0.05，图1(a))，说明GO对斑马鱼脑CYP1B1含量造成了比较显著的影响，PAHs-GO01组的CYP1B1含量亦显著下降。与CYP1B1含量类似，GO01和GO1组斑马鱼脑组织β-半乳糖苷酶含量下降，其中GO01组β-半乳糖苷酶含量下降23.90%，GO1组β-半乳糖苷酶含量与对照组相比显著下降(P<0.05，图1(b))，下降50.27%。与此同时，与对照相比，PAHs-GO01组和PAHs-GO1组也同样出现了β-半乳糖苷酶含量下降现象，分别下降12.14%和35.05%(P<0.05)，而PAHs组中β-半乳糖苷酶的含量与对照组相比无显著性差异。

图1 GO组、PAHs组和PAHs-GO复合暴露组对成年斑马鱼脑CYP1B1含量及β-半乳糖苷酶含量的影响注：*代表实验组相对于对照组有显著性差异(P<0.05)。Fig.1 Influences on brain CYP1B1 content and β-galactosidase content induced by GO,PAHs,PAHs-GO co-exposure in adult zebrafishNotes:*denote significant differences at P<0.05 compared with the control group.

2.2 GO、PAHs和联合暴露对成年斑马鱼转录组的影响

为探究GO和PAHs和复合物对斑马鱼脑组织的分子水平的影响，对暴露组和对照组的斑马鱼脑组织进行了转录组研究。使用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)和聚类分析对不同组别(包括对照组)基因表达相似度进行了分析，结果如图2所示。对照组与GO1组、PAHs-GO1组和PAHs组之间的皮尔森系数分别为0.966、0.966和0.942(图2(a))。对于皮尔森系数而言，2组之间比较的r2越接近于1，则2组之间的基因表达相似度越高。所以在皮尔森系数分析中，GO1组和PAHs-GO1组相对于PAHs组来说，其基因表达更接近于对照组。然而，值得注意的是，在皮尔森系数分析时，GO1组和PAHs-GO1组的系数相同，无法判断GO1组和PAHs-GO1组基因表达相对于对照组的区别。因此，采用聚类分析来分析3个暴露组与对照组的基因表达区别，结果如图2(b)所示。聚类分析的结果显示，PAHs组基因的表达与对照组差异最大，而GO1组的基因表达是3个暴露组中最接近对照组的，PAHs-GO1组与对照组基因表达的差异介于GO1组和PAHs组之间。

图2 GO组、PAHs组和PAHs-GO复合暴露组之间转录组基因表达差异分析注：(a) 皮尔森系数分析；(b) Hclust聚类分析。Fig.2 Analysis of differential expressed gene expression among GO,PAHs,PAHs-GO groupsNotes:(a) Pearson’s coefficient analysis;(b) Hclust analysis.

2.3 GO、PAHs和联合暴露诱发的成年斑马鱼脑组织DEGs的分析

根据1.4中DEGs的筛选标准，本研究中转录组DEGs数量和分布情况如图3所示。由3(a)～3(c)可知，GO1组引起的斑马鱼脑组织转录组的变化最小，共有61个DEGs，其中上调DEGs 29个，下调DEGs 32个；PAHs组包含最多的DEGs，其中上调DEGs 123个，下调DEGs 39个；PAHs-GO1组包含的DEGs介于GO1组和PAHs组之间，其中上调DEGs 34个，下调DEGs 59个。对3个暴露组的DEGs进行了分析，其结果如图3(d)所示。在本研究中，3个暴露组共引起了251个基因的显著变化，20个DEGs为3个暴露组共有，27个DEGs为GO1组和PAHs组共有，28个DEGs为GO1组和PAHs-GO1组共有，27个DEGs为GO1组和PAHs组共有，30个DEGs为PAHs-GO1组和PAHs组共有。总体而言，3个暴露组两两之间的共同DEGs数量虽然相近，但每个暴露组独有的DEGs数量却相差很大，转录组学结果表明不同的暴露组合引发的分子毒性是不同的，且从诱发斑马鱼脑组织DEGs的数量上看，3个暴露组的排序为GO1组

图3 GO1、PAHs和PAHs-GO1组诱发的斑马鱼转录组DEGs分布图注：(a)～(c)分别为GO1、PAHs和PAHs-GO1组DEGs的数量火山图；(d)为GO1、PAHs和PAHs-GO1组之间DEGs的韦恩图；DEGs代表显著差异表达基因。Fig.3 DEGs and analysis in zebrafish of control,GO1 group,PAHs group and PAHs-GO1 groupNotes:(a)～(c) represent the amount volcano figure of DEGs in control,GO1 group,PAHs group and PAHs-GO1 group,respectively;(d) represents the Venn diagram of DEGs in control,GO1 group,PAHs group and PAHs-GO1 group;DEGs was short for differential expressed genes.

由表2可知，在20个3个暴露组共有的DEGs中功能涉及细胞代谢(如ckma)、紧密连接(myhc4和mylpfa)、钙离子转运(atp2a1l和pvalb2等)和细胞骨架等(tnni2b.2和tpma等)。且除krt5在GO1组中上调、RCVRN在3个暴露组中上调外，其余DEGs在3个暴露组中的表达相比于对照组均显著下调，说明在受到外界影响，尤其是纳米材料、PAHs亦或是二者皆有的情况下，生物组织代谢以及细胞骨架等会率先响应，这种现象在既往研究中也有证实[26-28]。而当考察3个暴露组中独有的DEGs时，3个暴露组的DEGs的功能也各有差异：GO1组包含氧化酶相关的DEGs，包括steap4和ncf1；而PAHs组中富集了能量代谢和紧密连接的相关基因，如uqcrfs1、cldnd和cldng等；PAHs-GO1组包含大量代谢过程相关的DEGs，如与有机环化合物代谢过程的arntl1a、氨基酸代谢相关基因gpt2l和膜转运相关基因acap3a等。

表2 部分差异基因的功能Table 2 Function of partial differential expressed genes

2.4 GO、PAHs和联合暴露诱发的成年斑马鱼脑组织基因通路变化的分析

从基因功能方面来看，基因的转录是调控生物过程的一个必不可少的方式。因而本研究将3个暴露组的DEGs进行了KEGG通路分析，GO1、PAHs和PAHs-GO1组的KEGG富集通路结果如表3所示。结果显示，GO1、PAHs和PAHs-GO1组的DEGs一共富集到了38个通路中，其中GO1、PAHs和PAHs-GO1组的DEGs分别富集到了17、25和25条基因通路。其中，GO1组显著变化生物通路(P<0.05)有2个，分别为紧密连接和初次胆汁酸的生物合成；PAHs组的显著变化生物通路(P<0.05)有4个，分别为紧密连接、细胞周期、心肌收缩和吞噬体；PAHs-GO1组的显著变化生物通路(P<0.05)有4个，粘着斑、ECM-受体相互作用、紧密连接和光转导。值得注意的是，紧密连接在3个暴露组中的通路富集基因数量均位于首位且均为显著变化生物通路(P<0.05)；不仅如此，GO1组、PAHs-GO1组和PAHs组在紧密连接通路上富集的DEGs分别为3、4和6个，且GO1组在紧密连接通路上富集的DEGs(MYH13、myhc4和mylpfa)在PAHs-GO1组和PAHs组中均有表达和富集，而cldng和cldnd是PAHs组中独有的DEGs。

表3 暴露组差异基因(DEGs)富集的基因通路Table 3 Function pathways of differential expressed genes (DEGs) in exposure groups

续表3通路名称Pathway name通路编号Pathway serial暴露组DEGs数量DEGs amount mapped to function pathways暴露组通路富集P值P value of exposure groupsGO1PAHsPAHs-GO1GO1PAHsPAHs-GO1氨基糖和核苷酸糖代谢Amino sugar and nucleotide sugar metabolismdre00520010-0.2559-视黄醇代谢Retinol metabolismdre00830010-0.1868-RNA转运RNA transportdre03013010-0.5377-mRNA监测途径mRNA surveillance pathwaydre03015010-0.3617-RNA降解RNA degradationdre03018010-0.3326-细胞周期Cell cycledre04110040-0.0055-p53信号通路p53 signaling pathwaydre04115020-0.0522-背腹轴形成Dorso-ventral axis formationdre04320010-0.1287-细胞粘附分子(CAMs)Cell adhesion molecules (CAMs)dre04514020-0.1451-嘧啶代谢Pyrimidine metabolismdre00240010--0.3535丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢Alanine, aspartate and glutamate metabolismdre00250010--0.15832-氧代羧酸代谢2-oxocarboxylic acid metabolismdre01210010--0.0825内质网中的蛋白质加工Protein processing in endoplasmic reticulumdre04141010--0.5341NOD样受体信号通路NOD-like receptor signaling pathwaydre04621010--0.1822光转导Phototransductiondre04744020--0.0127

3 讨论(Discussion)

纳米材料进入水环境中，通过物理化学作用与有机污染物相互作用，可以通过影响有机污染物的生物可利用性和生物富集性影响污染物毒性。目前关于纳米材料和有机污染物复合污染的研究有一定的报道[15,29-30]。本文中我们探索了GO与环境浓度PAHs对成年斑马鱼复合暴露诱发的脑组织酶含量的变化及复合暴露分子机理。

首先，在酶水平上，GO1组和PAHs-GO1组均显著降低成年斑马鱼脑组织β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶含量。β-半乳糖苷酶是一种典型的细胞衰老标志物，其含量与细胞衰老速度相关[31-32]；另外，在生物细胞中，β-半乳糖苷酶的表达也同一些疾病的潜在风险密切相关[33]。而CYP1B1酶是抗氧化酶的一种，可以对外源化学物质进行功能化反应[34-35]。Zindler等[14]的研究指出，自由溶解态的菲与羧基碳纳米管对大型溞进行复合暴露后，使得菲的半最大效应浓度降低了25%～40%，从而增加菲对大型溞的毒性效应。在本文中，GO01组、GO1组、PAHs-GO01组和PAHs-GO1组均可诱发β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶含量下降，甚至GO1组和PAHs-GO1组与对照组相比有显著下降的趋势，但是PAHs组却与对照组相比无显著差异，GO01组与PAHs-GO01组、GO1组与PAHs-GO1组亦无显著差异。造成这种结果的原因可能有二：(1)本文选取的GO和PAHs均为环境预测浓度和环境浓度，与既往相关复合暴露研究的浓度(碳材料10 mg·L-1以上、PAHs为70～735 μg·L-1)相比较低，因而两者复合暴露时诱发的典型毒性效应(如酶含量)的差异不明显；(2)GO对有机物如PAHs存在一定的吸附效应[14,22]，而复合暴露组与其对应的单独GO暴露组诱发的毒性效应在酶含量上非常相似，因此，我们有理由推论，在本文提供的复合暴露条件下，在对成年斑马鱼的酶的毒性效应的影响中GO是占据主导地位的。

分子水平上，GO与环境浓度PAHs对斑马鱼成鱼脑组织复合暴露诱发的效应与生物酶的结果不同，各暴露组诱发的基因水平变化的顺序为PAHs组>PAHs-GO1组>GO1组。3个暴露组诱发的共有DEGs仅占DEGs总数的8.0%，包括细胞代谢、紧密连接、钙离子转运和细胞骨架等基础功能，部分功能的基因表达变化已在本课题组之前的工作中进行了验证[25]；而每个暴露组独有的差异基因的高占比说明在分子层面上，单独GO、单独PAHs和PAHs-GO复合后的毒性机理是总体来说区别仍然很大。尤其是PAHs作为一种经典的环境污染物，虽然在本研究的浓度下未对β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶的含量造成显著影响，但是分子层面上，PAHs诱发了紧密连接蛋白相关基因cldnd和cldng的下调。有报道指出，cldng和cldnd是编码紧密连接蛋白(claudin)的重要基因，而紧密连接蛋白的下调可能会引起生物血脑屏障的损伤[36-37]；而在GO1组和PAHs-GO1组中这2个基因并未出现显著变化，说明PAHs对生物血脑屏障的影响可能更明显，这可能是由于PAHs具有脂溶性，可通过代谢途径导致生物细胞DNA和蛋白的损伤或产生活性氧簇，从而诱发细胞的损伤[38]。而在GO1组中，变化较为突出的基因功能以及相关的基因通路均与生物代谢和细胞骨架等功能相关，而这正是GO诱发的斑马鱼典型的分子效应[25,39]，同时与PAHs组对比可发现，GO1组在氧化酶相关基因的变化表现(如steap4和ncf1)要大于PAHs组，与本文中CYP1B1酶在GO组的变化趋势大于PAHs组的结果相一致。

在PAHs-GO1组中，复合暴露组诱发的DEGs所在的基因通路与GO1组和PAHs组均有15条通路相同，说明PAHs-GO1组的毒性效应在分子机理上兼具GO1组和PAHs组的特点，同时也说明了2点：(1)PAHs-GO1复合暴露组兼具GO和PAHs的分子毒性效应的特点与β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶的结果相呼应，即，其诱发的效应在2个单独暴露组中间；(2)虽然GO在水环境中会对PAHs产生吸附，且在对成年斑马鱼脑组织效应中GO占主导地位，但是在分子层面上，与GO共同存在的PAHs依然具有分子毒性，而且在复合后可能会诱发新的基因通路变化，值得我们注意；(3)本研究中采取的GO浓度和PAHs的浓度相对较小，在自然环境中，水体中PAHs的含量可能因为环境突发事件或者水文条件改变等发生变化，因而GO与动态变化的PAHs的复合暴露效应是值得进一步深入研究。本研究结果可为后续相关的环境浓度纳米材料与环境污染物之间的相互作用和复合毒性效应提供了重要的参考资料，同时也可为研究GO与自然环境污染物的复合毒性机理研究提供了研究思路及技术研究手段。