CD44阳性肾小球壁层上皮细胞在早期预测局灶节段肾小球硬化中的价值

杨晓青，黄岩杰，杨月丽，任献青，丁 樱，翟文生，张琳琪

原发性局灶节段肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)和微小病变肾病(minimal change disease,MCD)是儿童和成人肾病综合征的常见病理类型[1]。光镜下MCD无明显病变，而FSGS可见局灶和节段的肾小球硬化以及上皮细胞肥大增生等病变[2]；电镜下两者均可见显著的肾小球足细胞足突融合病变[2-3]。光镜下早期FSGS病变呈局灶性和节段性，且常发生于皮髓交界区肾小球[1]。因此，早期FSGS和MCD难以鉴别[4]。近年研究显示，FSGS的早期肾小球壁层上皮细胞(parietal epithelial cell,PEC)活化，并从肾小球包曼囊壁向毛细血管袢迁移启动了肾小球节段硬化的发生[5-7]。CD44属于细胞黏附分子家族，是重要的肿瘤干细胞标志物[8]，也是肾小球PEC活化的标志[9]，参与细胞侵袭、转移过程。Smeets等[2]研究显示检测肾小球PEC活化标记CD44有助于鉴别早期FSGS和MCD，但是该研究未对CD44表达进行定位分析，也未对预测的早期FSGS进行临床病理分析。本文检测肾小球PEC特异性标记Claudin-1[10]和活化标记CD44在肾小球的表达和定位，并结合患者的临床治疗和随访信息明确其诊断价值，为临床与病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年1月～2020年12月河南中医药大学第一附属医院肾脏病理实验室18例原发性FSGS和54例MCD标本。其中18例FSGS患者中男性13例，女性5例；儿童8例，成人10例；年龄5～48岁，平均(23.22±15.06)岁。54例MCD患者中男性30例，女性24例；儿童34例，成人20例；年龄1～56岁，平均(19.79±16.02)岁。所有患者肾活检时均表现为肾病综合征。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡组织3 μm厚连续切片，常规脱蜡，免疫组化采用EnVision法。抗原修复(pH 6.0枸橼酸高温高压修复3 min)；滴加兔抗人CD44和Claudin-1抗体，均购自Abcam公司(稀释比1 ∶100)。4 ℃孵育过夜，PBS冲洗；滴加Polink-2增强型染色试剂，购自北京中杉金桥公司。先加聚合物辅助剂37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，再加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG多聚体37 ℃孵育20 min，PBS冲洗；DAB显色；苏木精复染细胞核；脱水，透明，封固，镜下观察。

1.3 判断标准MCD诊断标准[11]：肾活检光镜下肾小球无明显病变，免疫荧光阴性或仅有IgM强度为“≤1+”的沉积，电镜下足细胞足突弥漫融合，无电子致密物沉积；临床以肾病综合征发病，并除外继发性肾脏疾病。按照D’Agati哥伦比亚FSGS病理分型标准[12]将FSGS分为顶端型、细胞型、门部型、经典型和塌陷型，并除外继发性FSGS[13]。18例FSGS患者包括顶端型8例、细胞型2例、经典型7例和塌陷型1例。FSGS门部型多为继发性，同期2例门部型病例尿蛋白水平低于肾病水平蛋白尿被排除。光镜下所有病例肾小球数≥10个。对CD44+PEC的MCD病例进行组织形态学分析和PAS染色，对比阳性位置的形态学特征。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，分别统计FSGS和MCD中CD44在肾小球基膜(glomerular basement membrane,GBM)上皮侧以及在肾小球包曼囊壁PEC的阳性率。

2 结果

2.1 FSGS中CD44和Claudin-1的表达采用免疫组化对PEC的特异性标记Claudin-1和活化标记CD44进行染色，18例原发性FSGS病例均可见CD44+PEC局灶节段定位于GBM上皮侧。CD44和Claudin-1阳性表达模式均为呈线状或小团块状分布于细胞膜和细胞质。顶端型FSGS(图1A、B)：肾小球尿极端PEC增生，其中部分PEC活化表达CD44。细胞型FSGS(图1C、D)：肾小球节段毛细血管内增生呈分叶状的毛细血管袢外PEC增生形成假新月体，增生的PEC和毛细血管袢内浸润的炎细胞表达CD44。经典型FSGS(图1E、F)：肾小球节段硬化区毛细血管袢外侧可见单层排列的PEC，其中部分PEC细胞活化表达CD44。塌陷型FSGS(图1G、H)：肾小球节段塌陷的毛细血管袢外PEC增生形成假新月体，增生的PEC活化表达CD44。18例原发性FSGS病例中，6例(33.33%)偶见CD44+PEC定位于肾小球包曼囊壁；Claudin-1在肾小球包曼囊壁PEC中表达。

图1 FSGS中CD44、Claudin-1的表达，EnVision法：A.顶端型FSGS，CD44阳性定位于肾小球尿极端GBM上皮侧和个别包曼囊壁PEC；B.顶端型FSGS，Claudin-1阳性定位于肾小球尿极端增生的PEC和包曼囊壁PEC；C.细胞型FSGS，CD44阳性定位于肾小球内浸润的炎细胞和节段增生区的GBM上皮侧；D.细胞型FSGS，Claudin-1阳性定位于肾小球节段增生区的GBM上皮侧和包曼囊壁PEC；E.经典型FSGS，CD44阳性定位于肾小球节段硬化区的GBM上皮侧和个别包曼囊壁PEC；F.经典型FSGS病例，Claudin-1阳性定位于肾小球节段硬化区的GBM上皮侧和包曼囊壁PEC；G.塌陷型FSGS，CD44阳性定位于肾小球节段塌陷区的GBM上皮侧；H.塌陷型FSGS，Claudin-1阳性定位于肾小球节段塌陷区的GBM上皮侧和包曼囊壁PEC

2.2 MCD中CD44和Claudin-1的表达54例MCD中，有3例(5.56%)可见CD44+PEC局灶节段定位于GBM上皮侧。54例MCD中有7例(12.96%)偶见CD44+PEC定位于肾小球包曼囊壁，其中1例(1.85%)同时在肾小球包曼囊壁和GBM上皮侧可见CD44+PEC(图2)，6例(11.11%)仅在肾小球包曼囊壁可见CD44+PEC。3例进行连续切片PAS染色显示：例1可见CD44+PEC肥大、周围系膜基质轻度增生；例2可见CD44+PEC肥大；例3可见CD44+PEC肿胀、空泡变性(图2)。

图2 MCD中CD44和Claudin-1免疫组化及PAS染色：A.CD44阳性定位于肾小球节段GBM上皮侧(箭头)，EnVision法；B.Claudin-1阳性定位于肾小球节段GBM上皮侧和包曼囊壁PEC(箭头)，EnVision法；C.肾小球节段系膜基质轻度增生，节段GBM上皮侧上皮细胞肥大(箭头)，PAS染色；D.肾小球节段GBM上皮侧见1个CD44阳性的上皮细胞(箭头)，EnVision法；E.肾小球节段GBM上皮侧见1个Claudin-1阳性上皮细胞(箭头)，EnVision法；F.肾小球节段GBM上皮侧上皮细胞肥大(箭头)，PAS染色；G.CD44阳性定位于肾小球节段GBM上皮侧(箭头)，EnVision法；H.Claudin-1阳性定位于肾小球节段GBM上皮侧和包曼囊壁PEC(箭头)，EnVision法；I.肾小球节段GBM上皮侧上皮细胞肥大(箭头)，PAS染色

2.3 FSGS、MCD中GBM上皮侧表达CD44+PEC与临床病理特征的关系18例原发性FSGS均可见CD44+PEC局灶节段定位于GBM上皮侧，提示CD44+PEC局灶节段定位于GBM上皮侧有助于诊断原发性FSGS，且特异性强。54例MCD中有3例(5.56%)可见CD44+PEC局灶节段定位于GBM上皮侧。3例患者均非激素敏感型肾病综合征，例1和例3经激素联合他克莫司治疗5个月尿蛋白转阴，病情稳定；例2病史2年，激素治疗过程中多次复发，尿蛋白持续阳性。

2.4 FSGS和MCD中肾小球包曼囊壁CD44+PEC与临床病理特征的关系18例原发性FSGS中，6例(33.33%)肾小球包曼囊壁可见散在CD44+PEC，其阳性率低于GBM上皮侧的CD44+PEC阳性率(100%)。54例MCD患者中，7例(12.96%)肾小球包曼囊壁可见散在CD44+PEC，仅1例(1.85%)同时见CD44+PEC定位于GBM上皮侧。6例(3.70%)MCD仅偶见肾小球包曼囊壁CD44+PEC，其临床表现均为激素敏感型肾病综合征。肾小球包曼囊壁PEC表达CD44提示有PEC活化，但如果活化的PEC未移行到GBM上皮侧，可能不具备参与FSGS病理损伤的能力。因此，可能也不具备诊断和早期预测FSGS的价值。

3 讨论

本组联合检测肾小球PEC特异性标记Claudin-1和活化标记CD44在原发性FSGS和MCD肾小球中的表达，结果显示100%的原发性FSGS均能检测到CD44+PEC在GBM上皮侧表达；94.44%的MCD中GBM上皮侧未检测到CD44+PEC。以上结果表明CD44+PEC在GBM上皮侧的表达可作为鉴别MCD和FSGS的可靠病理特征。Smeets等[2]的研究显示87%的FSGS肾小球节段性表达CD44。两组病例阳性率有差异，可能与两方面因素有关：(1)本实验纳入病例的肾小球数目多、更容易检测到CD44+PEC；(2)Smeets等的研究纳入的病例均为成人，临床表现为肾病水平蛋白尿，且文中没有提供FSGS病理分型信息；而本组纳入病例包括儿童和成人，临床表现均为肾病综合征，病理分型以顶端型FSGS病例为主。

为进一步明确CD44+PEC定位于GBM上皮侧，而不是肾小球包曼囊壁，对于诊断和早期预测FSGS更具特异性。本组将CD44+PEC表达于肾小球包曼囊壁和GBM上皮侧分别进行统计，结果显示：100%的FSGS在GBM上皮侧均见CD44+PEC，而仅33.33%的FSGS可同时在肾小球包曼囊壁见CD44+PEC。本组MCD患者中有11.11%仅在肾小球包曼囊壁见CD44+PEC，1.85%同时在包曼囊壁和GBM上皮侧见CD44+PEC，3.70%仅在GBM上皮侧见CD44+PEC。虽然Smeets等[2]未对FSGS和MCD患者肾组织中CD44+PEC进行准确定位，但报道的95例MCD和FSGS中CD44+PEC仅有4%定位于肾小球包曼囊壁。Zhao等[14]在大鼠糖尿病肾损伤研究中发现，正常大鼠偶见肾小球包曼囊壁CD44+PEC，但糖尿病肾病大鼠肾小球包曼囊壁CD44+PEC明显增多；白蛋白可诱导体外原代培养大鼠PEC表达CD44。Hayashi等[15]在环孢霉素A诱导的FSGS动物模型研究中发现，在形态学显示早期FSGS病变(肾小球包曼囊壁与毛细血管袢形成上皮细胞桥)前18周即可见肾小球包曼囊壁PEC表达CD44。以上研究结果提示，病理状态下多种原因可诱导肾小球包曼囊壁PEC表达活化标记CD44。因此，CD44只在肾小球包曼囊壁表达不能作为诊断FSGS的可靠标志物；而PEC活化后迁移到GBM上皮侧，具有辅助诊断和早期预测FSGS的临床价值。

为深入探讨CD44+PEC定位于MCD患者GBM上皮侧的临床意义，本实验对GBM上皮侧检测到CD44+PEC的3例MCD患者肾组织进行连续切片PAS染色，结果显示CD44+PEC胞体肥大、偶见空泡，可伴周围基质增多，但未见明显节段硬化病变。3例MCD患者均为非激素敏感型肾病综合征，例1和例3均经激素联合他克莫司治疗5个月后尿蛋白转阴性；例2病史2年，激素治疗过程中多次复发，最近一次发病经激素和他克莫司治疗未能转阴性。因此，这3例MCD患者不能除外FSGS的诊断，需继续观察治疗效果和预后，必要时重复肾活检以明确诊断。王慧等[16]报道6例激素抵抗型MCD发展为FSGS。Smeets等[2]的研究显示，25%的MCD患者肾小球中检测到PEC活化标记CD44，但是研究者未对PEC的活化标记进行定位分析，也未对这些患者进行临床病理分析。

综上所述，联合检测PEC特异性标记Claudin-1和活化标记CD44在GBM上皮侧表达，可用于诊断和早期预测FSGS；仅见肾小球包曼囊壁PEC表达CD44不是诊断早期FSGS的可靠证据。