小针刀疗法对类风湿性关节炎大鼠TNF-α及lL-6的影响

洪志评，张 芸，李泰标，郑丁炤，吴心虹

（厦门市第五医院，福建 厦门 361101）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性全身性自身免疫病，主要病理变化为炎性滑膜炎。病变侵犯全身多个关节，以手、足小关节起病多见，具有多关节、对称性、关节外病变的特点，也可侵犯其他系统变生他病。晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形，影响人们的日常生活。RA 的病因尚未完全明确，病理机制亦尚未完全阐明，多种源自免疫系统和滑膜组织的细胞及其分泌的细胞因子参与了疾病的发展。目前治疗上多使用非甾体类抗炎药（NSAIDS）、抗风湿药物、生物制剂等，但长期用药易导致严重的胃肠道症状和肝、肾方面的损伤[1]。

小针刀近年来发展迅速，临床实践表明通过针刀系统治疗可改善类风湿性关节炎患者的症状，提高生活质量[2-3]。小针刀疗法在临床中除了改善局部关节的变性组织，通过松解迷走神经走行中周围的粘连、挛缩、堵塞，改善局部供血，调控神经平衡，达到治疗类风湿性关节炎的作用，但缺乏有效的理论依据。本文通过观察小针刀疗法松解迷走神经周围组织对RA 的治疗作用，进一步研究小针刀疗法治疗RA的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SPF 级SD 大鼠共30 只（体重180～220g），雌雄各半，由厦门大学实验动物中心提供（许可证号：SYXK(闽)2013-0006）。

1.1.2 主要试剂TNF-α ELISA 试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；IL-6 ELISA 试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；RNA 提取试剂盒（Promega，型号：LS1040）；逆转录试剂盒（Promega，型号：A5001）；QPCR 荧光染料（全式金，型号：AQ101-03）。

1.1.3 主要仪器SYL-2-6 恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；Stepone Plus 荧光定量PCR仪（ABI）；H2500R-2 高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MULTI-SKAN FC 酶标仪（赛默飞）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分组SD 大鼠30 只，雌雄各半，分为三组，即正常组（C）、模型组（N）、针刀组（M），每组10 只，除对照组10 只注射0.1mL 生理盐水外，其余各鼠用体积分数为5%水合氯醛（按100g 体质量注射0.8mL）腹腔麻醉后，于大鼠左后足跖底部常规皮肤消毒后，拉直大鼠左侧后肢，用1mL微量注射器皮内进针至左后足跖，注射完全弗氏佐剂0.1mL 致炎，注射前用75%乙醇轻拭注射部位，造模7天后检测RF 阳性，证明造模成功，随机分为模型组、针刀组各10只。

1.2.2 干预方法 对照组、模型组不予特殊处理；针刀组：常规备皮、消毒，选用一次性针刀，规格0.4mm×40mm，进针时刀口线与大鼠身体纵轴平行，刀体与皮肤切面垂直刺入，针刺至茎突前缘、茎突尖、颈1～颈7 后结节，当刀刃接触骨面时，纵行剥离2次，每周2次，共4周。

1.2.3 动物处理 采用10%水合氯醛（0.3mL/kg）腹腔注射麻醉后，开腹开胸，取肾脏，处死前腹主动脉采血3mL，离心抽取血清，-20°C冰箱保存。

1.2.4 ELISA 实验 各组TNF-α、IL-6 测定的操作步骤严格按照试剂盒说明书执行，见图1（以检测IL-6为例）。

图1 ELlSA实验步骤

1.2.5 QPCR 实验 取滑膜组织在研钵中加液氮充分研磨，依照RNA 提取试剂盒（Promega）方法提取总RNA，依照逆转录试剂盒（Promega）方法逆转录为cDNA，使用ABI Stepone plus 仪进行荧光扩增，GAPDH 作为内参照反应程序。反应扩增条件：95℃30s、95℃5s、60℃30s、72℃1min，共45 个循环。检测基因序列详见表1；根据采用2-ΔΔCt公式计算目的基因的相对表达量，以正常组mRNA 的表达量作为“1”，再根据校正值计算出模型组及针刀组TNF-α、IL-6 mRNA相对含量。

表1 引物序列表

1.3 评价指标

1.3.1 观察项目 致炎前及干预4周后检测大鼠左后足爪肿胀评分及关节炎指数评分。（1）关节炎评分：无关节红肿记0 分，趾关节红肿记1 分，趾关节和足跖肿胀记2分，踝关节以下足爪肿胀记3分，踝关节在内的全部足爪肿胀记4分；每个关节最高为4分，4个关节累计积分即为每只大鼠的关节炎指数评分。（2）足爪肿胀评分：RA 模型大鼠每只足爪包括5 只指关节或趾关节、1 只腕关节或踝关节，每个小关节出现结节和红肿记为1分。

1.3.2 检测项目ELISA 法测定血清中TNF-α、IL-6含量；荧光定量PCR实验检测滑膜中TNF-α、IL-6 mRNA表达水平。

1.4 统计方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料以均值加减标准差（±s）表示，多组间及治疗前后比较采用单因素方差分析（One‐way ANOVA），组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett′s T3检验；无序计数资料以频数（f）、构成比（P）表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿胀及关节炎情况 与正常组比较，模型组后足爪肿胀评分及关节炎指数评分增加（P＜0.01），提示造模成功，见图2；与模型组比较，针刀组左后足爪肿胀评分及关节炎指数评分减小（P＜0.05），详见表2。

图2 正常组及模型组大鼠左后足趾肿胀情况大体照片

表3 各组大鼠左后足爪肿胀评分及关节炎指数评分比较（± s，n=10）

表3 各组大鼠左后足爪肿胀评分及关节炎指数评分比较（± s，n=10）

注：与正常组比较，⑴P＜0.01；与治疗前比较，②P＜0.05；与模型组比较，③P＜0.05

组别正常组模型组针刀组例数10 10 10时间治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后足爪肿胀评分关节炎评分00 00 3.21±0.52⑴3.35±0.46⑴3.18±0.57⑴2.05±0.33⑴②③5.14±0.38⑴4.98±0.53⑴5.28±0.42⑴3.69±0.66⑴②③

2.2 血清指标 模型组TNF-α 较正常组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），模型组IL-6 虽较正常组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），可能与实验大鼠数量较少有关；针刀组血清TNF-α、IL-6水平较模型组降低（P＜0.05），见图3、图4。

图3 各组大鼠血清TNF-α表达情况

图4 各组大鼠血清lL-6表达情况

2.3 滑膜QPCR 模型组及针刀组滑膜组织TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平较正常组升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；针刀组TNF-α、IL-6 mRNA 表达较模型组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图5、图6。

图5 各组大滑膜中TNF-α mRNA表达情况

图6 各组大滑膜中lL-6 mRNA表达情况

3 讨论

近年来，炎症因子网络持续的激活/调节异常与自身抗原刺激的免疫反应，成为类风湿性关节炎慢性炎症存在的主要原因[4]。目前认为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α,TNF-α）、IL-6、IL-17直接参与了类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）关节及关节软骨的炎症及破坏。本实验中，模型组左后足趾明显红肿，血清及滑膜中TNF-α、IL-6 均较正常组升高，说明造模成果，支持此观点。

基于炎症因子学说，采用抑制体内促炎因子的多种途径成为寻找RA 治疗策略的主要方法。研究发现，中枢神经系统与免疫系统之间具有一条通路可以拮抗炎症反应，即胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway），其是由迷走神经及其递质乙酰胆碱和胆碱能受体所构成[5]。当迷走神经受刺激时，神经信号传递首先到腹部，接着通过第二条神经进入脾脏[6-7]，随后释放一种去甲肾上腺素神经递质[8]，这个神经递质可以直接与脾脏中的免疫T 细胞“交流”，刺激免疫T细胞释放另一种神经递质乙酰胆碱与脾脏中的巨噬细胞结合，进而阻止巨噬细胞产生炎症蛋白。《Nature》发表的评论文章报道，通过对8 名类风湿关节炎患者电流刺激迷走神经每天4次，6周后发现其症状明显改善，炎症细胞因子（TNF-α和IL-6）显著下降[9]。大量动物实验结果亦表明，刺激迷走神经和使用胆碱能激动剂在急性全身性炎症中可抑制TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1 等炎症因子的生成和释放，抑制NF-κB 信号通路，发挥抗炎作用[5]。因此，针对迷走神经的刺激有望成为治疗自身免疫性疾病较好的方法。

小针刀疗法在类风湿性关节炎方面具有独特疗效。根据临床报道，小针刀可以调整机体免疫功能，改善血液流变学和微循环，对粘连、瘢痕、挛缩或钙化等变性组织有切割作用，对应力性纤维组织和病变膨胀的滑囊，可使滑液溢出，也可起到减张作用[10]。针刀治疗RA 的方法各有不同，但大部分以各大小关节的关节囊及关节周围软组织为治疗点[11]。本实验通过松解大鼠茎突前缘、茎突尖、颈1～颈7 后结节，松解迷走神经走形中的粘连、挛缩，刺激迷走神经，结果显示针刀组血清TNF-α、IL-6 水平较模型组降低（P＜0.05），针刀组TNF-α、IL-6 mRNA 表达较模型组显著降低（P＜0.01）。由此可见，小针刀刺激迷走神经具有调控神经平衡、抑制炎症因子释放的作用，从而治疗类风湿性关节炎。上述的《Nature》文章作者在后续报道中提及在迷走神经刺激暂停14 天后，炎症细胞因子又出现了一定程度的增加[12]，故小针刀的远期疗效还有待进一步研究。

综上所述，本实验通过对足爪大体情况及基因、蛋白水平检测血清与滑膜中的典型炎症因子，初步探讨了小针刀疗法治疗类风湿性关节炎的可能作用机制：小针刀通过刺激迷走神经，能有效降低血清中TNF-α、IL-6水平，并下调滑膜组织中TNF-α、IL-6 mRNA的表达，减轻滑膜炎症反应，故小针刀疗法可能成为治疗类风湿性关节炎较好的方法之一。