不同盐浓度东北农家酱挥发性风味物质的差异分析

刘东傲，解双瑜, ，李 智，李天一，彭 媛，孙 波,

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.芜湖职业技术学院食品与生物工程学院，安徽芜湖 241002）

东北农家酱是我国东北地区的一种传统发酵食品，它是以大豆、食盐与水为原料经过自然发酵形成的半固态调味品。由于其生产过程是在开放环境中进行的，因此原料与环境中的大量微生物菌群都会进入其中参与发酵过程。其中许多不同种类的有益微生物菌群利用自身增殖与代谢过程中所产生的丰富酶类经过一系列复杂的生理生化反应将大豆原料中的蛋白质、碳水化合物等大分子物质部分地进行生物降解分解成小分子的多肽、游离氨基酸、还原糖类等物质，同时也完成了酒精的发酵，有机酸、高级醇和酯的形成等发酵过程，从而形成农家酱的独特风味。但是在这个发酵过程中也会有许多有害微生物菌群与有益微生物竞争营养物质并产生具有不良风味甚至有食品安全风险的代谢产物。因此在实际生产中通常采用添加一定浓度食盐的方式来控制这些微生物菌群的增殖与代谢活动。然而当食盐的添加量过低时，食盐对有害微生物菌群不能起到有效的抑制作用，进而无法控制其不良风味代谢产物的生成。当食盐添加量过高时，虽然能够有效抑制有害微生物菌群的增殖与代谢活动，但同时也会在一定程度上抑制有益微生菌群增殖与代谢活动，不利于其产品风味的形成，同时也不符合现代人对于低盐健康食品的追求。因此在东北农家酱的发酵过程中对食盐的添加量精准控制是至关重要的。

气相色谱-质谱（GC-MS）分析是目前在食品挥发性成分的定性与定量分析中应用最广泛的分析手段之一。其在食品中可用于产品质量控制、加工产品成分鉴定、样品差异性分析等方面，在发酵豆制品中也有非常广泛的应用。电子鼻是一种模拟人体生理嗅觉的智能感官分析设备，在各种食品的气味评价中均有广泛的应用。与GCMS 相比，电子鼻的操作更加简便，数据结果稳定，但电子鼻无法对挥发性风味物质的具体成分进行分析。而近年来，气相色谱-质谱结合电子鼻技术对食品的风味进行研究已成为一个热门课题，其中也包括在部分豆酱类产品中的应用。然而目前联用技术在豆酱类产品挥发性风味物质研究中的应用仍然较少，一般都采用单一仪器分析的方式，且研究内容大多围绕发酵过程中风味的监控与不同产品之间的差异分析。鲜少有围绕盐浓度对豆酱类产品挥发性风味物质影响的研究。

基于此，本文通过HS-SPME-GC-MS 对不同盐浓度东北农家酱发酵过程中挥发性风味物质进行检测并结合电子鼻研究其风味特征变化；同时利用主成分分析（PCA）和聚类分析等多元统计手段对不同样品之间的差异性进行分析。其目的是对食盐在东北农家酱发酵过程中挥发性风味物质生成所产生的影响进行初步探究，为未来低盐化东北农家酱工业生产提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆 黑龙江农垦北安管理局红星农场；盐中盐天津市长芦盐业有限公司；对甲氧基苯甲醛内标（纯度≥98%）美国Sigma-Aldrich 公司。

XZG-3-A 旋转蒸锅 温州市博泰机械科技有限公司；GC-2014AFSPL 气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；50/30 μm 固相微萃取三相头（DVB/CAR/PDMS）上海安谱科学仪器有限公司；PEN3 型便携式电子鼻 德国Airsense 公司；LG10-2.4A 高速离心机 北京医用离心机厂；FA2004 分析天平 上海衡平仪器仪表厂。

1.2 实验方法

1.2.1 东北农家酱的生产工艺流程 大豆→除杂→浸泡→蒸豆→卡块→制曲→曲块入酱缸→加盐水→发酵→打耙、晒酱→灌装封袋→杀菌→成品。

操作要点：室温下将除杂后的大豆在泡豆池中用自来水浸泡8～12 h 至充分膨胀无硬芯，送入旋转蒸锅中进行加压蒸煮，蒸煮条件：压力为0.15 MPa、时间为30 min。蒸煮结束后进行粉碎并使用模具卡块制成30 cm×20 cm×10 cm、重约6 kg 的曲块。再用牛皮纸包裹后置于温度：18 ℃、湿度：60% RH 的曲室中约60 d 制成成熟酱曲。选择9 个150 kg 的酱缸，在每个酱缸中加入30 kg 粉碎后的成熟酱曲与70 kg 水，然后分别按酱曲与水总量的8%（W/W）、10%、12%的比例加盐，每个盐浓度3 个酱缸。在25 ℃条件下进行自然发酵，每天上、下午各打耙一次，60 d 后发酵结束。上述发酵生产过程均在黑龙江农垦北安管理局红星农场北大荒亲民有机食品有限公司东北农家酱生产车间完成。

1.2.2 东北农家酱发酵过程中的样品采集 发酵0、30、60 d 时在酱缸同一位置进行取样，每次取样量均为200 g。将上述所有样品按表1 进行编号后在-18 ℃条件下密封保存并用于GC-MS 与电子鼻进行检测分析。

表1 东北农家酱样品编号Table 1 Sample number of Northeast farmhouse soybean paste

1.2.3 东北农家酱挥发性风味物质的收集与分析

1.2.3.1 顶空固相微萃取 分别取样品5.0 g 加入20 mL 样品瓶并加入1‰的对甲氧基苯甲醛内标溶液20 μL，将样品瓶放入60 ℃的水浴中平衡10 min；将老化6 min 的50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）萃取针头插入样品瓶，将石英纤维头暴露于样品瓶的顶空气体中，60 ℃恒温水浴萃取30 min 后，插入GC-MS的进样器于250 ℃条件下解析1 min，同时启动仪器采集数据。

1.2.3.2 气相色谱-质谱检测 色谱条件：进样口温度250 ℃，载气He，流速1.0 mL/min。采用程序升温方式，由室温升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃在此温度下保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，不分流进样。

质谱条件：MS 离子源在225 ℃全扫描，电离方式：EI，电子能量70 eV；扫描质量范围：50～500 amu。

1.2.3.3 挥发性风味物质定性、定量方法及气味活性值分析 挥发性风味物质的定性分析：利用计算机对采集到的质谱图进行检索，辅助人工解析图谱，与NIST02.L 标准谱库进行对照匹配。

挥发性风味物质的定量分析：根据内标物的浓度、样品中各组分的峰面积与内标峰面积的比值，通过下列公式计算农家酱样品中各组分的含量。

式中：C 为待测东北农家酱挥发性成分含量（μg/kg）；A为待测东北农家酱的峰面积（AU/min）；C为内标物的质量浓度（μg/μL）；A为内标的峰面积（AU/min）；V 为内标的加样量（μL）；m 为样品质量（kg）。

OAV 分析：采用OAV 评价各化合物对样品总体风味的贡献；OAV≧1 的组分为样品的关键风味物质，0.1≦OAV＜1 的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用。风味阈值通过查阅文献，按下式计算OAV 值：

式中：C 为挥发性化合物含量（μg/kg）；T 为该化合物的察觉阈值（μg/kg）。

1.2.4 东北农家酱电子鼻检测

1.2.4.1 样品前处理方法 称取5 g 东北农家酱样品于20 mL 电子鼻样品瓶中，然后置于55 ℃下水浴加热20 min，25 ℃下平衡10 min 后插入电子鼻探头对东北农家酱样品中挥发性风味物质进行采集，并由10 个金属氧化电极对其进行数据采集和分析。

1.2.4.2 电子鼻检测方法 表2 为PEN3 型便携式电子鼻传感器性能描述。测试条件：样品测试时间75 s，采集周期1.0 s；载气为高纯空气，流速150 mL/min，顶空注射体积500 μL，注射速度500 μL/s，注射总体积2.5 mL，平行测定3 次，清洗时间120 s，内部流量300 mL/min，样品流量300 mL/min。电子鼻检测器经校准后，将前处理好的样品按顺序放入电子鼻样品托盘中进行分析。

表2 电子鼻传感器性能描述Table 2 Electronic nose sensor performance description

1.3 数据处理

每个样品试验均独立重复三次。单因素方差分析与显著性分析采用SPSS 22（IBM,美国）进行（＜0.05）；主成分分析（principal components analysis,PCA）采用SIMCA-P+13 软件（Umetrics，瑞典）进行并绘图；聚类分析与相关性分析采用R version 4.1.2（Bird Hippie）及Origin 2021 进行并绘图。

2 结果与分析

2.1 不同盐浓度东北农家酱样品中挥发性风味物质分析

采用HS-SPME-GC-MS 联用技术对发酵过程中不同盐浓度东北农家酱进行挥发性风味物质检测，共鉴定出挥发性化合物67 种，它们在不同盐浓度东北农家酱样品中的组成如图1 所示。其中，酯类物质18 种，酸类物质14 种，醇类物质13 种，萜烯类物质5 种，酚类物质4 种，杂环类物质4 种，酮类物质4 种，醛类物质3 种，硫醚类物质2 种。而OAV≥0.1 的风味物质有20 种，其结果如表3 所示。

表3 不同盐浓度东北农家酱样品中挥发性风味物质的OAVTable 3 OAV of volatile flavor compounds in Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

图1 不同盐浓度东北农家酱样品中挥发性风味物质组成Fig.1 The composition of volatile flavor compounds in Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

发酵0 d 时，OAV≥0.1 的挥发性风味物质只有两种，且这两种物质的OAV 值在8%、10%、12%盐浓度样品中无显著性差异（＞0.05）。其中，三甲基吡嗪的OAV 值大于1，可以认为三甲基吡嗪是发酵0 d样品中的重要挥发性风味物质。

发酵30 d 时，OAV≥0.1 的挥发性风味物质为12 种，其中，8%盐浓度样品中有12 种，10%和12%盐浓度样品中各有8 种。而这12 种挥发性风味物质中OAV＞1 的关键风味物质有9 种，包括苯乙醛、异戊酸乙酯、苯丙酸乙酯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、丁香酚、愈创木酚、吲哚和三甲基吡嗪。其中，三甲基吡嗪与发酵0 d 相比有显著增加（＜0.05）。随着盐浓度的增加，除丁香酚和愈创木酚外其它每种关键风味物质的OAV 均显著下降（＜0.05）。丁香酚只存在于8%盐浓度样品中，而愈创木酚只存在于12%盐浓度样品中。

发酵60 d 时，OAV≥0.1 的挥发性风味物质为20 种，其中，8%盐浓度样品中有19 种，10%盐浓度样品中有11 种，12%盐浓度样品中有10 种。而这20 种挥发性风味物质中OAV＞1 的关键风味物质有12 种，包括苯乙醛、辛酸乙酯、异戊酸乙酯、苯丙酸乙酯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、苯酚、愈创木酚、丁香酚、吲哚、2,5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪。其中，辛酸乙酯、苯酚与2,5-二甲基吡嗪为发酵60 d时首次出现的关键风味物质，而其它9 种关键风味物质与发酵30 d 相比均有显著增加（＜0.05）。随着盐浓度的增加，除愈创木酚外其它每种关键风味物质的OAV 均有显著下降（＜0.05）。虽然苯酚存在于8%、10%盐浓度样品中但只有在8%盐浓度样品中为关键风味物质。而愈创木酚只存在于12%盐浓度样品中。

由上述实验数据可以看出，在同一盐浓度条件下，随着发酵时间的延长，样品中风味物质的种类及OAV 值均呈现出了增加的趋势。而在相同的发酵时间，随着盐浓度的增加样品中风味物质的种类及OAV 值大部分呈现出下降的趋势。发酵0 d 时样品的风味物质主要来源于酱曲中蛋白酶分解蛋白质的过程，因此此时的风味物质种类较少并且与后续发酵过程中的风味物质存在一定差异。而在后续的发酵过程中，盐浓度越高，其对微生物的抑制作用越强，样品中参与发酵过程的微生物越少，因此，风味物质的种类和OAV 值与盐浓度呈现出负相关的趋势。

2.2 不同盐浓度东北农家酱样品电子鼻传感器响应值结果

不同盐浓度的东北农家酱样品电子鼻传感器响应值结果如图2 所示。发酵0 d 时样品的10 个传感器响应值均低于10，其中，W1C、W3C、W5C、W2W传感器的响应值相对较高。这表明在发酵0 d 时东北农家酱中可能存在着氨类、烷烃类和有机硫类等化合物。发酵30 d 与60 d 时样品随发酵时间的增加其W5S、W6S、W1S、W1W、W2S、W3S 传感器响应值均有增加；而W1C、W3C、W5C、W2W 传感器的响应值均有减少。这表明在整个发酵过程中可能有甲基类、醇类、醛酮类化合物等物质增加而氨类物质、短链烷烃与有机硫化物等物质减少。在发酵0 d 时，8%、10%、12%盐浓度样品之间传感器响应值并无明显差异，而在发酵30 d、60 d 时样品随盐浓度的增加其W2W 传感器的响应值增加，而W5S、W6S、W1S、W1W、W2S、W3S 传感器响应值均有减少。这表明盐浓度的增加会促进有机硫类化合物的产生，抑制烷烃类、醇类与氢化物类化合物的产生。

图2 不同盐浓度东北农家酱样品电子鼻数据变化雷达图Fig.2 Radar chart of electronic nose data of Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

2.3 不同盐浓度东北农家酱样品的主成分分析结果

不同盐浓度东北农家酱样品的主成分分析结果如图3 所示。其中，a 为挥发性风味物质的PCA 结果，其PC1 为93.0%，PC2 为1.9%，前两个主成分累计方差贡献率为94.9%，可以代表挥发性风味物质的总体信息。b 为电子鼻的PCA 结果，其PC1 为80.4%，PC2 为8.7%，前两个主成分累计方差贡献率为89.1%，可以代表电子鼻数据的总体信息。

图3 不同盐浓度东北农家酱样品的主成分分析图Fig.3 PCA of Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

从两个PCA 图可以看出，发酵0 d 时样品都集中横坐标的左侧，发酵30 d 与60 d 时样品随发酵时间的增加整体向横坐标的右侧移动。在发酵0 d时，8%、10%、12%盐浓度样品之间距离很近，说明发酵0 d 时不同盐浓度样品之间差异很小。而在发酵30 d 与60 d 的样品中，随着盐浓度的增加样品在横坐标上逐渐从右向左移动，且不同盐浓度样品之间的距离逐渐增加。其中，8%盐浓度样品与10%、12%盐浓度样品之间距离较远，而10%与12%盐浓度样品之间的距离较近，说明8%盐浓度样品与10%、12%盐浓度样品之间差异较大，10%与12%盐浓度样品之间的差异较小。这与前面HS-SPME-GCMS 的分析结果相一致。

2.4 不同盐浓度东北农家酱样品的热图与聚类分析

图4 中a 为不同盐浓度的东北农家酱样品中OAV≥0.1 的挥发性风味物质的热图与聚类分析。9 组东北农家酱样品可以分为3 类，其中，LS1、MS1、HS1、MS2、HS2 为一类；LS2、MS3、HS3 为一类；LS3 为一类。聚类分析结果表明，发酵0 d 时8%、10%、12%盐浓度样品之间相似度较高，而这3 个样品与发酵30 d 时10%、12%盐浓度样品之间也存在一定的相似性，发酵30 d 8%盐浓度样品与发酵60 d 10%、12%盐浓度样品相似度也比较高，而发酵60 d 8%盐浓度样品与其他所有样品都存在着一定差异。图4 中b 为不同东北农家酱样品电子鼻传感器响应值的热图与聚类分析。图中9 组东北农家酱样品可以分为3 类，其中，LS1、MS1、HS1 为一类，LS2、MS2、HS2 为一类，LS3、MS3、HS3 为一类。聚类分析结果表明，相同发酵时间的样品相似度较高。图4中聚类分析的结果与PCA 的结果相似，这说明盐浓度会对东北农家酱的风味产生显著的影响。这是由于参与其发酵过程中不同微生物菌群对盐浓度耐受性差异很大，随着盐浓度变化这些微生物菌群增殖及代谢产物生成也会相应发生变化所造成的。

图4 不同盐浓度东北农家酱样品的热图与聚类分析Fig.4 Heat map and cluster analysis of Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

3 结论

本研究采用顶空固相微萃气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）与电子鼻技术对不同盐浓度（8%、10%、12%）东北农家酱发酵过程中（0、30、60 d）挥发性风味物质的变化与风味特征进行检测并通过PCA 与聚类分析对样品间的差异性进行统计分析。结果表明盐浓度会对东北农家酱发酵过程中的挥发性风味成分的生成产生显著影响，当盐浓度越低时其风味成分种类及含量就越丰富。该实验结果不仅有利于提升产品质量与风味，而且也为开发低盐化产品提供理论支持。应该注意的是盐浓度对东北农家酱中微生物菌群多样性及其代谢机制的影响目前尚不明确。所以未来仍然需要在确保东北农家酱食品安全的前提下减少食盐添加量，在促进挥发性风味物质生成方面进行更深入研究。