蛇床子素对肝癌HepG细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响*

肝癌的发病诱因与遗传、饮酒、饮食、寄生虫和病毒性肝炎有关，早期无特异性症状，当出现明显肝区疼痛、发热等临床症状时，大部分患者已确诊为肝癌中晚期

。肝癌的治疗主要涉及手术切除、血管介入、射频消融和中药治疗等，虽然现代医学在肝癌治疗方面表现较好的控制效果，但依旧存在术后复发和预后较差情况

。中药对恶性肿瘤的治疗作用日益凸显，蛇床子是具有祛风燥湿、温肾壮阳的传统中药，蛇床子素是蛇床子活性成分之一，有研究表明蛇床子素具有抗炎、抗心率失常、抗肿瘤和改善缺血再灌注损伤功效

，但其相关作用机制仍未完全阐明。本研究观察蛇床子素对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭的抑制作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和动物 实验细胞：人肝癌HepG2细胞购自中国科学上海细胞研究所，将肝癌HepG2细胞置于DMEM培养基(10%胎牛血清)、37℃、5% CO

培养箱中培养，进行隔天换液，取第3代细胞用于研究。实验动物：3～4周龄雌性BALB/c裸鼠，60只，体重12～15 g，购自南方医科大学SCXK(粤)2016-0041，饲养环境为SPF级动物饲养房，温度26～28℃，湿度40%～60%，人工光照12 h/昼、12 h/夜，自由饮水进食。严格遵守3R原则。

1.2 主要试剂 蛇床子素购自上海源叶生物科技有限公司；MTT试剂盒购自中国上海易汇生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；结晶紫染液购自美国Sigma公司；RNAprep pure细胞试剂盒、Reverse Transcriptase Kit购自中国天根生化科技北京有限公司；2×HSYBR qPCR Mix购自中国北京庄盟国际生物基因科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Matrigel胶购于美国Clontrch公司；Cyclin D1、Cyclin B、CDK1、Bcl-2、Bax、cleaved PARP、E-cadhein、N-cadherin、vimentin、p-JAK和p-STAT3抗体购自武汉益普生物科技有限公司；cleaved caspase-3抗体购自爱必信(上海)生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 实时定量PCR仪(LightCycler® 96)购自中国罗氏诊断产品上海有限公司；荧光显微镜(DFM-60D)购自中国上海蔡康光学仪器有限公司；冷冻离心机(Selectspin

17R)购自美国Select BioProducts公司；Transwell小室购自北京索莱宝科技有限公司；CO

培养箱购自日本SanYo公司；多功能酶标仪(SpectraMax iD3)购自美国Molecular Devices公司；流式细胞仪(Aurora 3L-5L)购自美国Cytek Biosciences公司。

1.4 MTT检测细胞活性 将人肝癌HepG2细胞以每孔3×10

个接种于96孔板，孵育12 h后，给予不同浓度蛇床子素(0、10、20、40、80、160、320 μmol/L)培养24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)培养4 h，每孔加入100 μl DMSO作用30 min，在570 nm波长测量光密度值，细胞活力计算公式=(实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。不同处理组均设5个复孔，实验重复3次。

当代陶艺是指艺术家运用陶瓷材料，突破原有的传统陶瓷精致的古典审美情趣，来表达现代人理想、个性、情感、心理、意识和审美价值的作品形式。

1.5 细胞克隆实验 将人肝癌HepG2细胞以每孔1 000个接种于6孔板，孵育12 h后，加入蛇床子素使其最终浓度分别为0、40、80、160 μmol/L，每组5个复孔，继续培养2周，多聚甲醛固定15 min，使用结晶紫染色30 min，冲洗，统计各组细胞的克隆形成数目，克隆形成率计算公式=(实验组克隆形成数目/对照组克隆形成数目)×100%。实验重复3次。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 同1.4方式处理人肝癌HepG2细胞，收集不同浓度(0、40、80、160 μmol/L)蛇床子素处理48 h细胞，1 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀，300 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl Annexin V/FITC和10 μl PI混合均匀，室温避光孵育15 min，上样流式细胞仪，检测细胞凋亡率。不同处理组均设5个复孔，实验重复3次。

4.党的全体党员。党员是党的机体的组成部分，每一个党员要强化角色意识，始终牢记党员身份，自觉践行入党誓词，用党员标准和条件要求自己，忠实履行党员义务，增强党性修养，主动接受组织生活的检验，清除思想上的灰尘，保持党员的先进性。同时，要把在党言党、在党忧党、在党为党、在党爱党落实到日常工作生活之中，自觉维护党和人民的利益，敢于同违反党内政治生活的现象作斗争。习近平同志指出：“严肃党内政治生活是每个党员、干部的事。”[1]

1.7 Transwell实验 将Matrigel胶涂Transwell上室，收集同1.4方式处理人肝癌HepG2细胞[蛇床子素(0、40、80、160 μmol/L)处理48 h]，给予细胞蛋白酶消化，将细胞悬液加入无血清培养基的Transwell小室(1×10

个)，下室加入500 μl完全培养基(含10%胎牛血清)，37℃、5% CO

培养箱中培养24 h，使用4%多聚甲醛固定附着在膜下表面细胞20 min，结晶紫染色5 min，随机5个不重叠视野，统计单个视野的侵袭细胞数目并以均值作为该组的单个视野细胞侵袭数目。

2.4 4组HepG2细胞凋亡及几种蛋白表达量 见图5、图6。

——6月24日，江西宣传部副部长、史学博士陈东有，以《金瓶梅的社会文化现象》为主题开了一场讲演。陈东有认为。

2.3 4组HepG2细胞Cyclin D1、Cyclin B和CDK1的mRNA水平及蛋白表达量检测情况 见图3、图4。

2.2 4组HepG2细克隆情况 见图2。

1.10 蛇床子素干预体内移植瘤 将60只BALB/c雌性裸鼠均左前肢腋下皮下注射100 μl肝癌HepG2细胞(1×10

/ml)，注射5 d后，随机数表法分为对照组和蛇床子素组，每组30只。蛇床子素组裸鼠腹腔注射蛇床子素30 mg/kg

，每2天注射1次；对照组裸鼠腹腔注射等体积的生理盐水。从HepG2细胞皮下注射日开始计算，统计30 d后移植瘤重量和体积，并取生长30 d的移植瘤组织用于western blot检测p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3蛋白相对表达量，操作方法同1.8。

2.5 4组HepG2细胞侵袭能力检测结果 见图7、图8。蛇床子素(40、80、160 μmol/L)处理肝癌HepG2细胞侵袭数目均显著低于对照组(

<0.05)，而N-cadherin和vimentin蛋白相对表达量显著低于对照组(

<0.05)，E-cadhein蛋白相对表达量显著高于对照组(

<0.05)。

1.11 统计学方法 使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，定量数据均以平均值±标准差形式表示，使用

-

(

-

)对定量数据的正态分布进行检验，两组间比较使用

检验，检验水准α=0.05(双尾)，作图软件为GraphPad Prism 5.0。

1.9 qRT-PCR检测 使用RNAprep pure细胞试剂盒提取细胞总RNA、Reverse Transcriptase Kit逆转录生成第一条链cDNA，2×HSYBR qPCR Mix用于qRT-PCR扩增，检测Cyclin D1、Cyclin B、CDK1 mRNA水平，以β-actin作为内参基因，mRNA水平以荧光阈值循环数(Ct)值输出，然后Livak与Schmittgen的2

公式计算待测基因mRNA水平。qRT-PCR扩增参数为95℃预变形3 min，95℃变形10 s，59℃退火30 s，72℃延伸10 s，40个循环。引物，：β-actin，前引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′、后引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；Cyclin D1，前引物5′-CCCTCGGTGTCCTACTTCA-3′、后引物5′-CTCCTCGCACTTCTGTTCCT-3′； Cyclin B，前引物5′-GCCAATAAGGAGGGAGCAGT-3′、后引物5′-ACCTACACCCAGCAGAAACC-3′；CDK1，前引物5′-TAGCGCGG ATCTACCATACC-3′、后引物5′-CATGGCTACCACTTGACCTGT-3′。所用引物均由生工生物工程上海股份有限公司设计合成。

2 结果

2.1 不同浓度蛇床子素作用不同时间对HepG2细胞活性的影响 见图1。

(2)改革工艺，减少产尘量。选煤厂适当提高入选上限，减少煤的破碎量，或适当调整破碎机的工艺参数，尽量减少过粉碎，均可大大减少煤尘数量。

当然，由于爵位高、加官多，霸府行台首长至少有两个以上的开府，宇文泰任霸府行台时以周惠达为大行台尚书和大将军府司马就是明证。其中霸府行台就是行台首长的行台开府，主要帮助首长处理军政事务，在霸府行台首长的开府中最能体现“霸府”性质。

1.8 western blot检测 蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，测定各组细胞蛋白浓度，使用Bradford法进行蛋白定量，然后SDS-PAGE分离，将30 μg蛋白转移至PVDF膜、室温密封2 h，洗膜并加一抗(Cyclin D1、Cyclin B、CDK1、Bcl-2、Bax、cleaved PARP、cleaved caspase-3、E-cadhein、N-cadherin、vimentin、p-JAK、JAK、p-STAT3、STAT3、GAPDH，1∶500)4℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗40 min，然后加入HRP标记二抗(1∶500)，37℃孵育2 h，ECL显色，收集条带影像。

从分析结果(见图4)来看：侧壁厚度越接近主壁厚，翘曲变形量越小。整体厚度趋近一致，收缩相对均匀，因此翘曲变形量相对较小。

2.6 4组HepG2细胞P-JAK和P-STAT3蛋白相对表达情况 见图9。

2.7 两组HepG2细胞移植瘤生长情况 见图10。

2.8 两组HepG2细胞p-JAK/JAK和p-STA3/STAT3蛋白表达情况 见图11。

3 讨论

肝癌是发病率位居第7、死亡率位居第4的消化系统恶性肿瘤，我国每年原发性肝癌新增46.6万人，占全世界肝癌新增病例一半以上，我国死于肝癌的患者约44.4万人/年，接近全世界因肝癌病逝人数的一半

。蛇床子素为蛇床子中的烃基香豆素，具有多种生物药用活性，可抑制乳腺癌进展、抗角膜新生血管生成、预防神经退行性疾病以及改善肺动脉高压等功效

。

本研究发现适当浓度蛇床子素可降低肝癌HepG2细胞的克隆形成率，说明蛇床子素可抑制肝癌HepG2细胞增殖，而细胞增殖在肿瘤组织扩大过程中发挥重要作用，其中调控机制极其复杂，主要有细胞周期相关基因、蛋白参与调控。本研究结果显示适当浓度蛇床子素可降低肝癌HepG2细胞中Cyclin D1、Cyclin B和CDK1 mRNA水平和蛋白表达。Cyclin D1是调节细胞周期运行的重要蛋白，对G1期细胞调控发挥关键性作用，可与细胞周期依赖蛋白结合，参与细胞周期调节过程

。Cyclin D1水平异常升高会引起细胞增殖异常，诱发细胞恶性病变

。Cyclin B可与CDK1蛋白结合产生促有丝分裂因子调节细胞有丝分裂进程，抑制其水平升高可阻碍细胞周期运转

。有研究表明蛇床子素可降低鼻咽癌CNE2细胞中的Cyclin D1和vimentin水平发挥抑制细胞增殖和侵袭作用

。本研究结果也具有相似趋势，说明蛇床子可能是通过降低Cyclin D1、Cyclin B和CDK1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖。

1）现代职业教育制度的初步试验。20世纪90年代中期，我国苏南地区的职业教育改革亮点频出，在产教融合和制度建设方面率先突破。当时的国家教委专门为此召开研讨会，研究和推广苏南地区的职业教育改革经验。1996年，国家教委的工作要点提出要“认真抓好苏南地区建设现代职业教育制度的改革试验工作”。

肿瘤细胞因其细胞增殖异常且细胞凋亡减弱导致细胞生长不受控制，恶性细胞生物学行为明显，本研究结果表明适当浓度蛇床子素处理可降低肝癌HepG2细胞的凋亡率和细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达量。细胞凋亡有多个途径介导，其中包括Caspases级联反应和线粒体介导途径，Caspases家族成员参与细胞生长、分化和凋亡等生理过程，Caspases一般生理活动状态下是以非活性酶原形式分布于细胞，接受凋亡信号刺激后形成催化活性。Caspases-3位于Caspases级联反应最下游，发挥执行者作用

。Bcl-2能够抑制DNA损伤引起细胞凋亡信号激活和改变线粒体膜电位，抑制自由基和过氧物产生，负向调节细胞凋亡

。Bax对提高细胞膜通透性具有促进作用，可诱导Caspases活化，促进细胞凋亡，Bax/Bcl-2比值变化可反映细胞凋亡情况

。PARP为DNA损伤的感受器，能够通过线粒体途径启动细胞凋亡，然后反馈激活Caspases-3诱导细胞凋亡

。已有研究表明蛇床子素可通过调节人急性B淋巴细胞Bax和Bcl-2水平促进细胞凋亡

。本研究结果与其趋势一致，说明蛇床子素可能通过激活细胞凋亡途径活化促进肝癌HepG2细胞凋亡。

恶性肿瘤患者经临床治疗后病情仍旧存在复发、转移风险，这与肿瘤细胞侵袭能力具有密切关系，本研究结果显示经适当浓度蛇床子素处理能抑制肝癌HepG2细胞的侵袭能力，同时还可降低肝癌HepG2细胞中的N-cadherin和vimentin蛋白表达量，增加E-cadhein蛋白表达水平。正常器官上皮组织由单层细胞构成，细胞间通过黏附蛋白黏附防止细胞移动，恶性肿瘤细胞易发生上皮-间质转化，降低细胞间的黏附能力，易向肿瘤周围组织转移

。E-Cadherin在肿瘤细胞上皮-间质转化时呈低表达，N-Cadherin蛋白和vimentin蛋白表达升高

。已有研究表明蛇床子素可抑制肺癌A549细胞上皮间质转化，本研究结果表现出相似趋势，说明蛇床子素可降低肝癌HepG2细胞侵袭能力。

JAK/STAT3信号通路参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡、炎性反应等多种进程，有研究表明抑制该信号通路可抑制某些恶性肿瘤细胞恶性细胞生物学行为

。本研究结果发现经适当浓度蛇床子素处理可降低肝癌HepG2细胞p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3蛋白表达量，并且裸鼠移植瘤体内实验也呈现出相同趋势，肿瘤组织重量和体积也明显降低。有研究表明西黄丸可通过降低肝癌HepG2细胞p-STAT3蛋白表达量来抑制细胞增殖和侵袭

。本研究结果也表现出相似趋势，说明蛇床子素对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的抑制作用、对细胞凋亡的 促进作用可能与抑制JAK/STAT3信号通路有关。

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