Wnt/β-catenin通路相关蛋白在乙型肝炎肝纤维化进程中的临床意义*

肝纤维化是由多种因素引起的肝脏疾病，持续的炎症反应会加速细胞外间质成分的生成和沉积进而促进纤维化进程，最终进展为肝硬化

。肝纤维化最常见的原因是HBV感染，但是抗病毒药物对于防治肝纤维化进展疗效有限

。Wnt/β-catenin通路与调节细胞增殖和分化、维持机体内稳态环境等有关，有研究报道，cAMP反应元件结合蛋白(CBP)/β-catenin相互作用的选择性抑制剂(PRI-724)通过抑制肝脏星状细胞活化和促进巨噬细胞介导的炎症消退，在小鼠肝纤维化模型中显示出抗纤维化作用

。本研究拟探讨Wnt/β-catenin通路相关蛋白在乙型肝炎肝纤维化进程中的变化和临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年6月至2020年11月在我院就诊的275例慢性HBV携带者或非活动性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者(HBV组，

=130例)和慢性乙型肝炎(CHB)患者(

=145例)。慢性 HBV携带者为血清HBsAg和HBV DNA阳性， HBeAg或HBeAb阳性，转氨酶在正常范围(1年内连续随访3次)， 肝组织学检查一般无明显异常。非活动性HBsAg携带者为血清HBsAg阳性，HBeAg阴性，HBV DNA低于检测值下限， 转氨酶在正常范围(1年内连续随访3次)， 肝组织学检查一般无明显异常或有轻微病变。CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准，HBsAg阳性超过6个月，并通过肝活检进行组织病理学评估，其中29例患者未发生肝纤维化(CHB组)，另116例患者发生肝纤维化(肝纤维化组)。在肝活检当天收集足够的血液标本用于后续分析。排除合并甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、自身免疫性肝病、肝脏毒性、酒精性肝病、阻塞性黄疸或肝癌患者。该研究获我院机构审查委员会批准并征得了参与者的书面知情同意。

1.2 研究方法

所以在足球课教学中，首先要打好基础，使学生的基本功渐于扎实，然后要安排各种活动性游戏和接近比赛条件的练习。提高基本技术在比赛中的实践能力，不仅会提升学生实践的积极性，而且还能促进学生将学习的知识应用于实践中，较快的形成自己的能力，从而使学生以较大的热情投入到足球课的学习中。

通过运用“行动素理论”对赵五娘形象进行分析，我认为赵五娘更多的是一个被外界影响的人物，而不是一个影响外物的人物，因此，我将外界对她的态度作为核心故事元素，确立X为“鼓励”，反X是“打击”，非X是“不鼓励”，反非X是“不打击”。矩阵如下图所示：

2.4 不同炎症分级肝纤维化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平比较 见表4。

这婚姻生活吧，有时候就像游戏关卡似的，每一个关卡比前面一个都更难，需要去一一面对和化解，但游戏的关卡是固定的，生活里却有这样那样不确定因素，需要夫妻俩合力去克服，争取在婚姻关卡里升级，一步步走向更好的未来。

1.2.2 肝纤维化分期和炎症分级 根据2000年西安会议方案进行肝纤维化组织学分期(S0～S4期)和炎症分级(G0～G4)

。S0为无纤维化，S1～S2为轻中度纤维化，S3～S4为进展期纤维化。

1.2.3 血清Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达测定 患者在入组后禁食8 h以上，取静脉血5 ml，进行离心操作后取上层清液用于后续检测。血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、Wnt诱导分泌蛋白-1(WISP-1)、Wnt信号通路抑制分子Dickkopf-1(DKK-1)使用酶联免疫吸附法进行测定，试剂盒购自武汉CUSABIO公司，操作过程根据试剂盒说明书操作。

2 结果

2.5 肝纤维化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平与肝功能和肝纤四项指标的关系 经Pearson法或Spearman法分析，血清Wnt-3a水平仅与CIV呈正相关性，血清Wnt-5a、WISP-1水平与ALT、PCⅢ、CIV、LN、HA呈正相关性，血清β-catenin与PCⅢ、CIV、LN、HA呈正相关性，而血清DKK-1水平与PCⅢ、CIV、LN呈负相关性(

<0.05)。见表5。

2.3 不同分期肝纤维化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平比较 见表3。

当线路短路故障引起断路器跳闸后，负荷中无法自启动的设备应自动跳闸。而负荷中允许重新带电的设备，则可以在断路器重合成功后恢复供电。重合闸时间的整定主要取决于短路点电弧的去游离时间。用户负荷中不能参加自启动的设备须自动跳闸。允许重新带电的负荷，在断路器重合后恢复供电，重合闸时间主要决定于故障点去游离时间。

2.2 患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1、DKK-1水平比较 见表2。

1.2.1 实验室检查 检测血清氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白、白蛋白、总胆红素(TBil)、间接胆红素(IBil)、PLT、 α-甲胎蛋白(AFP)、血清HBV感染标志分子、肝纤维化标志物。定量检测HBsAg使用Elecsys HBsAg Ⅱ定量分析仪(德国罗氏诊断公司)和配套试剂进行检测；采用实时聚合酶链式反应(QPCR)法检测HBV DNA。采用化学发光法检测血清肝纤维化标志物水平。其他常规生化指标用全自动生化分析仪测定。

2.1 患者一般资料 见表1。

2.6 血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1水平对进展期肝纤维化患者的诊断价值 经ROC曲线分析，血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1水平诊断进展期肝纤维化患者的曲线下面积分别为0.786(95%

：0.691～0.882)、0.957(95%

：0.917～0.997)、0.973(95%

：0.949～0.996)，截断值分别为220.85 pg/ml、82.34 ng/ml、0.25 ng/ml。见图1。

2.7 单因素和多因素Logistic回归模型分析血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1水平与肝纤维化进展的关系 根据ROC曲线分析得到的最佳截断值，血清Wnt-5a≥220.85 pg/ml、血清WISP-1≥82.34 ng/ml、血清DKK-1≤0.25 ng/ml作为指标异常。以是否进展至S3～S4期作为因变量(发生=1，未发生=0)，将年龄、性别等一般资料和血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1异常表达情况作为自变量纳入回归模型，结果显示，血清Wnt-5a、WISP-1、DKK-1标记物异常和肥胖、吸烟史与肝纤维化进展风险独立相关(

<0.05)。见表6。

3 讨论

HBV感染可导致多种肝脏疾病，包括急性和慢性乙型肝炎、HBV相关的肝硬化和肝细胞癌

。尽管已经出现了有效的疫苗以及其他的疾病控制措施，但HBV相关慢性肝脏疾病仍然是一个严重的全球健康问题。HBV相关肝纤维化进展机制是复杂的，病毒和宿主因素都可以影响HBV感染导致的肝损伤结果。众所周知，Wnt/β-catenin通路是肝癌发生、发展的重要机制，乙型肝炎病毒X蛋白(HBVx)蛋白和HBsAg可以作为致病因子参与Wnt/β-catenin通路的调节和诱导，从而促进肝癌的发生

。一些研究也尝试使用小分子靶向Wnt/β-catenin途径作为肝癌治疗的潜在应用

。但是Wnt/β-catenin通路激活在HBV相关肝纤维化进展中的作用研究尚处于起步阶段。本研究发现，乙型肝炎肝纤维化患者血清Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin、WISP-1水平普遍升高，同时血清DKK-1水平则低于HBV组和CHB组患者；而且随着肝纤维化疾病进展，进展期肝纤维化患者血清Wnt-5a、WISP-1水平高于轻中度纤维化患者，同时血清DKK-1水平低于轻中度纤维化患者；血清Wnt-5a、WISP-1水平升高和/或DKK-1水平降低是参与乙肝肝纤维化进程的独立危险因素。

概念分层提供了有用的背景知识，有利于试验简明的高层术语表达发现模式，并有助于多个抽象层的知识挖掘。这实际上就是对多边矩阵剖面的选择。

Wnt/β-catenin通路与细胞的自我更新、增殖、分化、迁移等过程具有密切联系，激活Wnt/β-catenin 信号通路与许多器官系统的纤维化有关，包括肺、肾、心脏、皮肤和肝脏

。小分子Wnt抑制剂在抗小鼠肺、肾和肝纤维化模型中被证明是非常有效的。例如Wnt/β-catenin信号通路阻断特异性阻断剂ICG-001可有效地抑制CBP/β-catenin相互作用减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化进程

。此外，ICG-001还能改善单侧输尿管梗阻引起的小鼠肾脏纤维化和逆转小鼠模型的晚期纤维化损伤

。最近的一项研究报道提出，CBP/β-catenin相互作用的选择性抑制剂(PRI-724)通过抑制肝脏星状细胞(HSCs)活化和促进巨噬细胞介导的炎症消退，在小鼠肝纤维化模型中显示出抗纤维化作用

。这些发现都表明阻断Wnt/β-catenin信号通路具有治疗肝纤维化的潜力。肝脏受损后，HSCs被激活，炎症细胞被吸收到损伤部位，以分泌大量促炎症因子和促纤维化因子，这些细胞因子直接或间接地激活HSCs

。细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖等，通过活化的HSCs过度产生并在肝脏中大量积累。

朱其荣等

在总结多种信号传导通路对肝纤维化的影响时发现，处于活化状态的HSCs中，典型Wnt通路(β-catenin)和非典型Wnt通路(Wnt-5a)相关蛋白分子在转录和翻译水平都较静止期HSCs细胞有所增加。另外还有多篇报道中也证明了这一点

。Beljaars等

在小鼠模型体外研究以及人肝脏组织实验中证实，在肝纤维化人体组织中Wnt-5a增加了大约7倍，而在正常肝脏中Wnt-5a表达水平极低，甚至可以说不存在。同样在诱导的小鼠模型中也证明了肝损伤的小鼠Wnt-5a表达上升。β-catenin是Wnt途径的中心介质，它是一种多功能蛋白质，被磷酸化激活后可以移位到细胞核中，作为转录辅助激活因子发挥作用，进而调节下游数百个致病基因的转录和翻译过程

。值得注意的是，β-catenin是可以作为分泌蛋白进入人体外周循环血中，并且在血清样本中也可以被检测到，这在其他的疾病中也有所报道

。WISP-1属于CCN家族成员，是Wnt/β-catenin通路活化后的下游靶基因之一。Li等

的研究显示，WISP-1具有促进细胞肥大和有丝分裂的作用，可刺激HSCs细胞活化和胶原蛋白表达，进而介导了肝纤维化进程。而给予其单克隆抗体后，可降低了CCL4诱导的炎症因子表达，说明WISP-1具有一定的促炎特性，这可能也是其参与肝纤维化进程的重要机制之一。此外，Wnt 信号在HSCs活化过程中被激活，有研究证实，Wnt受体拮抗剂DKK-1可以抑制Wnt信号转导，促进HSCs恢复至静止期或凋亡

。在本研究中，血清Wnt-5a和WISP-1高水平表达和DKK-1低水平表达有助于判断肝纤维化进展程度，而且这3项指标的变化对于判断肝纤维化进展风险与其他临床因素无关。

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