6个柳杉品种雄球花及其花粉形态特征对比

陶依玲，闫亚丹，李鑫玉，翁怀峰，文亚峰，邵凤侠

（1.中南林业科技大学 风景园林学院，湖南 长沙 410004；2.福建省霞浦国有林场，福建 霞浦 355100）

柳杉属杉科Taxodiaceae柳杉属Cryptomeria常绿大乔木，分为柳杉Cryptomeria japonicavar.sinensis和日本柳杉Cryptomeria japonicavar.japonica两个种。柳杉雌雄同株，雄球花单生叶腋，成短穗状花序。花期4月，果10月成熟。柳杉是我国特有树种[1]，主要分布于我国长江以南地区，近年来，云南、广西、广东、安徽、江苏、河南、山东等地均有引进栽培。柳杉具有材质优良、树形优美、适应性强、生长快等优点，是优良的园林绿化与用材树种。

柳杉具有较高的生态与经济价值，适应性强且分布广泛。但在现阶段，柳杉存在品种数量少、品种单一等问题，在一定程度上限制了柳杉的推广应用。在植物的生长演化过程中，花粉不易受到外部环境的影响，其形状大小、表面纹饰等形态特征较为稳定，花粉遗传具有保守性[2]。而花粉的形态特征等生物学特性，既是植物杂交育种的生物学基础，也是物种种质鉴定的重要依据[3]，并且花粉的形态特征研究能够为物种的亲缘关系以及起源和演化提供可靠依据[4-5]。因此培育柳杉新品种，选育出多粉多花、花粉质量高的优良授粉品种是柳杉育种工作中的重要目标之一。我国对柳杉的研究目前主要集中于种质遗传资源、种群遗传、人工林[6-9]以及病虫害[10-12]等方面，而关于柳杉雄球花和花粉以及育种方面的研究比较少见。柳杉是风媒花，花粉必须经过从雄球花到胚珠孔的过程才能完成受精，而花粉的质量越轻、体积越小，花粉量越大，可使得传播距离更长，提高授粉效率[13-15]。因此研究柳杉的花粉及其形态特征非常必要。本研究通过对6个柳杉品种雄球花及其花粉形态结构的对比研究，探究不同品种柳杉雄球花及花粉结构上的异同以及相互之间对应的关系，筛选出适合作为柳杉授粉良种的品种，为柳杉新品种的育种工作打好基础并提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料取自福建霞浦杨梅岭国有林场的6个不同柳杉品种：‘黄龙11号’‘日本011’‘本场68号’‘81种源Q18’‘87种源R6’以及‘林场007’，均选取树龄为20 a、生长状态良好的植株采集样本。

1.2 研究方法

1.2.1 雄球花形态观察

于2021年3月，采集散粉期或散粉前期带有雄球花的枝条。于Leica S6D型体视显微镜下观察单小枝雄球花及单雄球花形态，拍照，并分别测量各品种单雄球花数量、质量、纵径、横径等形态特征。

1.2.2 单球花粉量的测定

取出完整未裂开的雄球花5枚，放入离心管中，25℃恒温烘箱中烘干，使雄球花完全裂开，倒出花粉，加入1 mL蒸馏水，充分震荡，使花粉粒均匀分布于溶液中，然后取5 μL溶液滴于载玻片上，显微镜观察并统计花粉粒数。

花粉量（每粒）=每张载玻片上的花粉粒总数×200。

1.2.3 花粉形态亚显微观察

采集散粉期或散粉前期的雄球花，经2.5%戊二醛固定48 h后，分别用PBS缓冲液、蒸馏水各清洗2次，依次经不同梯度浓度的酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱 水，过渡到叔丁醇中后，冷冻干燥；干燥后的样品在JFC1600型离子溅射仪中镀金20 min后，于JSM-6380LV型扫描电子显微镜下进行观测。选择具有代表性的视野观察花粉的形态并拍照记录。利用电镜测量工具，随机选取10个花粉测量花粉形态指标，重复3次。花粉形态指标包括极轴长（P）、赤道轴长（E）及极赤比（P/E）。小孢子叶的处理与花粉一致。

1.3 数据处理分析

采用Excel 2016软件进行数据统计及平均值的计算。采用SPSS 25.0软件进行显著性检验及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种雄球花的形态特征

对不同品种柳杉的雄球花外观进行显微观察，并对其纵径、横径、单球质量、雄球花粒数以及花粉量进行测量，结果见图1～3及表1。

表1 雄球花外观特征†Table 1 The appearance characteristics of the male cones of C.japonica var.sinensis

图1 6个品种带雄球花小枝及单个雄球花形态观察Fig.1 Stereomicroscope observation on the branchlets with male cones and single male cones of the six varieties of C.japonica var.sinensis

由体式显微镜观察结果（图1）可知，6个品种柳杉雄球花均集生于小枝上半部分，外观形状均为长椭圆形，由多个小孢子叶沿中轴呈螺旋状排列。6个品种柳杉单枝雄球花的数量、外观大小等存在一定差异。其中，‘黄龙11号’单枝雄球花数最少，体积最小，体型为细长椭圆形，着生于小枝上部但不在顶端，生长紧凑，叶片较大、较长，颜色浅绿。‘日本011’雄球花体型椭圆，着生于小枝顶端，生长较紧凑，叶片较小，颜色深绿。‘本场68号’雄球花形体型为较矮胖的椭圆形，横径大，纵径小，着生于小枝上部分，生长较紧凑；叶片较大，颜色浅绿，雄球花上的小孢子叶下部分能清楚地看到花粉囊的位置及数量（图1c）。‘81种源Q18’小枝和雄球花最为细长，雄球花体型为细长的椭圆形，着生于小枝上部分，生长稀疏，穿插于叶片之间，叶片较大，为绿色。‘87种源R6’雄球花为椭圆形，小枝较其他品种短，雄球花体积较大，集生于小枝顶端，生长紧凑，叶片小，颜色浅绿。‘林场007’雄球花上部分尖，集生于小枝上部分，生长较紧凑，叶片小，较宽，颜色深绿。

对6个不同品种柳杉雄球花大小及花粉量进行测量，结果见图2。6个品种柳杉雄球花的纵径、横径、单球质量、雄球花粒数以及花粉量存在显著性差异。‘黄龙11号’除花粉量外，其余指标均最小，花粉量仅次于‘林场007’及‘本场68号’。‘81种源Q18’雄球花纵径最大，但单球质量较小。‘本场68号’横径最大，单球质量最重。‘林场007’单球质量最小，横径最小，纵径处于中间值，但柳杉单枝上雄球花粒数以及花粉量最大。

图2 6个品种柳杉雄球花及花粉形态特征Fig.2 Morphological characteristics of male cones and pollen of the six varieties of C.japonica var.sinensis

对各品种小孢子叶进行扫描电子显微镜观察，结果见图3。小孢子叶分腹面及背面，腹面着生有多个花粉囊，花粉囊沿叶柄排列在小孢子叶下方，表面有网状纹饰，散粉时花粉囊纵向开裂。不同品种柳杉的小孢子叶上花粉囊数量不一致，‘黄龙11号’‘日本011’‘81种源Q18’花粉囊数量为3～4个；‘本场68号’花粉囊数量为3～5个；‘林场007'花粉囊数量有4～6个，‘林场007’花粉囊数量最多，‘本场68号’次之。图2结果显示：‘林场007’单雄球花的花粉量最大，其次为‘本场68号’。

图3 6个品种柳杉小孢子叶及花粉囊Fig.3 Observation on microsporophyll morphology of the six varieties of C.japonica var.sinensis

2.2 不同品种花粉的形态特征

通过扫描电子显微镜对6个品种柳杉的花粉形态进行观察，结果（图4）可知，6个品种的花粉都为单粒花粉，花粉粒形态相近，为球形或近球形，未见萌发孔，极面观以及赤道面观都为圆形或近圆形，在花粉远极面具有一个乳头状突起，乳头状突起直立或向一侧弯曲，其长度在5.4～6.4 μm之间，附近外壁较薄，远极面有时向内凹。柳杉花粉壁的表面纹饰为两种不同直径的瘤状颗粒，小直径的颗粒排列紧密，覆盖在花粉表面，大直径刺瘤状颗粒分布不均，散落或成堆重叠在小直径颗粒之上。

进一步对6个品种柳杉的花粉大小进行测量，结果见表2。‘黄龙11号’花粉极轴长25.53 μm，赤道轴长22.99 μm，P/E值为1.110，花粉表面小直径颗粒紧密覆盖，大直径刺瘤状颗粒纹饰分布稀疏，远极面内凹时乳头状突起周围外壁多被小直径颗粒覆盖；‘日本011’花粉极轴长27.84 μm，赤道轴长25.09 μm，P/E值为1.110，花粉表面大直径刺瘤状颗粒纹饰分布稀疏，但比‘黄龙11号’分布多；‘本场68号’花粉极轴长28.25 μm，赤道轴长25.65 μm，P/E值为1.101，表面大直径刺瘤状颗粒纹饰分布与日本011相差不大；‘81种源Q18’花粉极轴长28.23 μm，赤道轴长25.82 μm，P/E值为1.094，花粉表面大直径刺瘤状颗粒纹饰分布稀疏；‘87种源R6’花粉极轴长28.84 μm，赤道轴长25.36 μm，P/E值为1.137，花粉表面大直径刺瘤状颗粒纹饰分布比前4个品种紧凑；‘林场007’花粉极轴长26.68 μm，赤道轴长25.01 μm，P/E值为1.066，花粉表面大直径刺瘤状颗粒分布在6个品种中最为紧密。

表2 6个品种柳杉花粉粒形态特征†Table 2 Pollen morphological characteristics of the six varieties of C.japonica var.sinensis

6个品种柳杉雄球花花粉的极轴长为22.72～33.21 μm，花粉的赤道轴长为19.56～29.18 μm。6个品种的P/E值范围为1.066～1.137，花粉均为球形或近球形。花粉粒体积最大的为‘81种源Q18’，最小的为‘黄龙11号’。

对6个品种柳杉花粉的极轴、赤道轴及极赤比进行差异显著性分析，结果（表3）可知，6个柳杉品种之间，花粉的极轴以及赤道轴都存在极显著差异（P＜0.01），说明各品种间的花粉大小存在显著性差异；而各品种间花粉极赤比差异不显著，这说明各品种间花粉形状无显著性差异。

表3 6个品种柳杉花粉粒大小显著性分析†Table 3 Variance analysis of pollen morphology of the six varieties of C.japonica var.sinensis

3 讨 论

雄球花是裸子植物的雄花序，其着生位置及花粉性状直接影响花粉传播效率以及授粉成功率，当雄球花着生于枝顶并居于树冠外层时能够有效地减小枝叶对传粉的阻碍作用，有利于植物的散粉以及授粉[14]。本研究中，‘日本011’与‘87种源R6’雄球花着生于小枝顶端，其余品种均着生于小枝上部，着生位置都有利于散粉。6个品种柳杉枝叶均较小，枝叶对花粉传播的阻碍作用较小。柳杉雄球花由小孢子叶沿中轴螺旋状排列而成，小孢子叶背部盾形、蜡质的特征可保护位于小孢子叶腹部的花粉囊。柳杉散粉期一般为雨季，小孢子叶背部特征可疏水，防止雨水进入花粉囊影响散粉。‘林场007’一般具有5～6个花粉囊，‘本场68号’为3～5个，其余品种均在2～5个之间，而花粉量最大的是‘林场007’，其次是‘本场68号’。根据花粉囊数量以及花粉量可推测，‘林场007’由于花粉囊数量多，产生了更大的花粉量，从而呈现出多花多粉多果的性状。因此，花粉囊数量可能是‘林场007’呈现多粉性状的主要缘由之一，此推测有待进一步论证。

植物花粉粒的大小、形状、数量等形态特征稳定、可靠，能够作为鉴别植物科、种、属的依据[16-17]。本研究中，柳杉属不同品种之间的花粉在形状、乳头状突起位置、外壁纹饰等方面的相似性表明各品种在属的水平上表现出一致性：花粉均为球形单粒花粉；极面观及赤道面观均为圆形或近似圆形；远极面具一个乳头状突起，附近外壁较薄；花粉粒外壁表面纹饰均分为两层不同直径的瘤状颗粒。这与席以珍[15]的研究结果一致。

6个品种间花粉的极轴、赤道轴存在极显著差异（P＜0.01），说明柳杉属不同品种（种）间植物花粉大小存在一定差异。6个品种柳杉的花粉特征在一定程度上也表现出差异性。冯琪等[18]认为同属不同种的植物花粉的外壁纹饰类型、形状极轴长度、P/E值既能反映种间差异，也能反映近缘物种间一定的亲缘和进化关系。

韩子云等[19]、张敏等[20]对不同科属裸子植物的花粉形态研究结果表明，同科不同属植物之间花粉形态存在一定差异性，且可从花粉外壁表面颗粒纹饰直径与小刺个数之间的关系、外壁微颗粒的分布位置、花粉表面颗粒上小刺的宽度与高度间关系等数据来区分鉴别。柳杉6个品种中，花粉粒表面纹饰的最大差异在于花粉粒表面大直径刺瘤状颗粒的数量及分布，‘林场007’花粉粒表面大直径刺瘤状颗粒最多，分布最为紧密，其次是‘87种源R6’；‘黄龙11号’花粉粒表面大直径刺瘤状颗粒最少，分布最为稀疏。关于花粉表面刺状结构，前人曾提出两种假说：第一种认为花粉表面的刺状纹饰结构能够有效地防止蜂类动物采集花粉；第二种则认为刺状结构有利于帮助花粉附着在传粉者身体表面，从而提高授粉效率。柳杉作为风媒植物无需附着于传粉者身体表面进行传粉，但蜂类以及蛾类动物的“偷粉”行为会对裸子植物的传粉和有性生殖适合度造成伤害[21]，在一定程度上影响了花粉的授粉效率。6个品种中，‘林场007’花粉粒表面刺瘤状颗粒最多，分布最为紧密，在第一种假说成立的基础上，可以认为‘林场007’花粉粒表面多刺瘤状颗粒的性状能提高花粉授粉率。针对第一种假说，后续可以进行进一步的研究，探究柳杉花粉表面纹饰结构对于提高花粉授粉率的作用。

植物花粉的传播距离受自身质量、体积、气温、风力、气压等多重因素影响[18]，但在不考虑外部气候因素的条件下，花粉的质量、体积等自身因素是影响传播距离的重要因素。本研究6个柳杉品种中，‘林场007’雄球花的单球质量最小，但花粉量最大，单位花粉粒的质量轻，且‘林场007’花粉体积小，结合其花粉量大、着生的花粉囊多等优点，认为就其花粉质量及其形态特征而言，‘林场007’品种可作为柳杉授粉良种，可以考虑将其用于柳杉品种的培育工作。在本研究中，对柳杉花粉的研究只局限于花粉的形态特征，而未对花粉活力及其萌发效率进行进一步的研究，下一步应对其进行更深层次的研究工作，并且可将‘林场007’品种应用于新品种选育工作以印证本文观点。

4 结 论

6个柳杉品种雄球花均着生于枝顶或小枝上部，枝叶较短小，枝叶对花粉传播的阻碍作用较小，有利于花粉的散发与传播，其中以“林场007”的小枝最短，为3.4±0.3 cm。6个品种柳杉雄球花均为长椭圆形，各品种之间雄球花的形态特征存在显著性差异。不同品种小孢子叶内观察到的花粉囊数量不一致，其中以‘林场007’花粉囊数量最多，其次是‘本场68号’。花粉量与花粉囊数量的观测结果具有相似的趋势，‘林场007’花粉量最大，‘本场68号’次之。各品种柳杉雄球花均为长椭圆形，花粉均为球形或近球形，小型花粉，花粉囊纵裂，各品种花粉粒大小存在显著性差异，但花粉形状无显著性差异，表明各品种在属的水平上具有一致性。就花粉质量、数量以及形态特征而言，‘林场007’相对于其他5个品种更具有授粉优势，可考虑将其作为柳杉授粉良种，应用于柳杉育种工作。