基于拉曼技术对高地钩叶藤纤维细胞壁成分微区分布的研究

汪佑宏，崔浩然，张菲菲，江泽慧，余林鹏，杨明亮，马建锋，田根林

（1.安徽农业大学 林学与园林学院，安徽 合肥 230036；2.黄山华塑新材料科技有限公司，安徽 黄山 245900；3.国际竹藤中心，北京 100102）

棕榈藤（rattan）是具有重要经济价值和开发前景的热带和亚热带森林中的植物资源，属于棕榈科Palmae藤类植物，全世界共有棕榈藤13属664种，其中我国自然分布有4属43种26变种（新增多鳞藤属Myrialepis），但具有较高经济价值的仅20～30种[1-3]。棕榈藤藤茎俗称藤条，长度从几米至170余米，直径从3～80 mm甚至高达200 mm不等，平均节间长度约20 cm。生长中的成熟藤茎，除基部外被带刺叶鞘所覆盖，成熟后的藤茎呈奶黄、乳白等颜色，为仅次于木材和竹材的具有多种用途的林产品，被广泛用于制造桌、椅、沙发、床等藤制家具，以及各种藤编小饰品等，具有一定的经济价值和开发前景[1-2]。

目前，对于棕榈藤的研究多集中在构造特征[4-7]、物理力学性质[8-9]方面，对于化学性质的研究涉及不多。棕榈藤材化学成分主要包括细胞壁成分纤维素、半纤维素、木质素，以及抽提物、灰分等，大多数传统的植物细胞壁的化学分析都是破坏性的，且仅仅显示了生物质中三大组分（纤维素、半纤维素和木质素）在宏观区域的含量和变异，如吴玉章[10]对单叶省藤、白藤和黄藤的化学组成进行了研究，尚莉莉[11]对钩叶藤纤维素、半纤维素含量的变异进行了研究，不能体现出化学成分的微观变异。同时，涉及到细胞壁微区化学成分变化的研究相对较少，如汪佑宏等[12-14]运用可见光显微分光光度计，对黄藤材导管、薄壁细胞和纤维细胞的木质素微区分布进行了研究。与可见光显微分光光度计法定性测量相比，刘杏娥等[15]结合共聚焦显微荧光和拉曼光谱成像技术系统，半定量地研究了黄藤材藤茎中不同类型细胞及同一细胞不同形态区域的木质素化学特点，得到了与Gierlinger等人[16]一致的研究结果。

总的来说，目前针对木材[17-18]、竹材[19-20]细胞壁化学成分的微区分布进行了较为详细的研究，对棕榈藤材细胞则仅集中在木质素微区分布上。如何利用拉曼光谱成像技术，对棕榈藤材细胞壁成分微区分布进行研究，对于构建其细胞壁结构模型、扩大棕榈藤材的用途、提高棕榈藤材的利用率有着十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高地钩叶藤Plectocomia himalayanaGriff.属棕榈科Palmae钩叶藤属Plectocomia，攀援、丛生、大径藤（藤径4～5 cm），主要分布于中国、不丹、印度、尼泊尔、老挝、泰国等国家，其中我国主要分布于云南南部、西南部、西部地区海拔1 450～1 800 m的竹林、山地常绿阔叶林中；其藤茎质地较粗糙，属于劣质材，一般用于编织较粗糙的藤器或栅栏[1-2]。

高地钩叶藤采自云南南部的梁河县平山乡，海拔为1 480～1 500 m，选取健康、生长适中的高地钩叶藤10株，齐根伐倒后，去除叶鞘，测得藤茎直径为13～30 mm，长16～20 m，节间长度为16.5～26.5 cm，每株藤材从基部向梢部每2 m长截成一段并编号，待用。

1.2 研究方法

1.2.1 软 化

选择1株高地钩叶藤（考虑到不同藤株间对应部位无法保证为相同年份，故只选择1株进行分析），在高2 m处截取长1 cm左右的试样。将截取的藤茎试样浸没在盛水的烧杯中，置于微波炉内“高火”档，按10 min/次加热，然后取出并迅速放入冷水中浸泡1 min左右；再按上述方法加热、冷却，如此循环至试样下沉、变软为止。

1.2.2 包 埋

将试样置于装有已溶的聚乙二醇（炭蜡）2000（Polyethylene glycol 2000）的容器中，移至真空干燥箱中按30 min/次重复抽真空16次；取出试样再置于聚乙二醇4000（Polyethylene glycol 4000）中，按上述方法继续抽真空16次后，取出试件至表面液体凝固并把表面多余的聚乙二醇固体刮除。

1.2.3 切 片

用Leica RM2265全自动轮转式切片机（Leica Biosystems Nussloch GmbH）切取厚10 μm且完好的横切面切片5片左右，室温下用0.2 mol·L-1NaBH4溶液浸泡5～6 h，然后用蒸馏水洗净并浸泡在蒸馏水中，备用。

1.2.4 数据采集

取出1片切片固定在载玻片上并置于拉曼显微镜下，分别在藤皮、藤中（藤皮、藤芯之间）及藤芯处各选择1个完整的纤维细胞，每个部位至少选择3个不同点，利用LabRam XploRA显微共聚焦拉曼光谱仪（Horiba Jobin Yvon公司），依次对细胞角隅（CC）、复合胞间层（CML）、次生壁外层（S1）、次生壁中层（S2）及次生壁内层（S3）采用逐点扫描显微探针成像方法获取光谱数据集。

光谱采集一般采用矩形扫描和直线扫描，矩形扫描主要用于成像分析，采谱时采用快速扫描功能，曝光时间0.66 s，扫描步长0.33 μm；直线扫描主要用于组分分析，曝光时间3 s，以提高光谱采集的信噪比。采集时计算机控制平台同步移动，为使自动平台移动实现较好的重复性（±0.2 nm）和较高的控制精度，应用光栅尺反馈控制技术，共对3个纤维细胞至少9个点的数据进行采集，再利用LabSpec5软件进行处理[21]。

其中扫描步长为0.8 μm，激发波长为532 nm，功率为8 mW，单点采集时间1 s，狭缝宽度100 μm，孔隙大小为300 μm，拉曼光谱测试范围为250～3 200 cm-1。为获得较高的空间分辨率（0.23 μm，0.61 λ/NA），采用了100倍油镜（MPlan 100×，oil，NA=1.35）采集拉曼信号。

2 结果与分析

2.1 藤纤维主要化学成分微区分布的线谱分析

图1为纤维细胞S2的平均拉曼光谱。图1中纤维素的主要特征峰为2 890、1 376、1 115、1 090、378 cm-1，木质素的主要特征峰为1 680、1 598 cm-1。拉曼位移2 890 cm-1归属于纤维素C-H和C-H2的对称伸缩振动，1 090 cm-1是纤维素C-O-C糖苷键的非对称伸缩振动，378 cm-1归属于纤维素β-D葡萄糖苷键。拉曼位移1 680 cm-1归属于松柏醇（或紫丁香醇）和松柏醛（或紫丁香醛）结构，1 598 cm-1归属于苯环的对称伸缩振动，而1 090 cm-1是重原子（C-C和C-O）的伸缩振动；对应的主要组分是纤维素、木聚糖、葡甘露聚糖（其中木聚糖与葡甘聚糖是组成半纤维素的重要物质）[22-24]。

图1 纤维细胞壁S2平均拉曼光谱Fig.1 Average Raman spectrum of S2 of fiber cell wall

图2a为5个不同形态区，即CC（细胞角隅）、CML（复合胞间层）、S1（次生壁外层）、S2（次生壁中层）及S3（次生壁内层）的平均光谱图，线谱范围为300～3 200 cm-1。在CC和CML线谱上，特征峰2 937 cm-1主要是木质素中甲氧基的C-H键的伸缩振动；而在S1、S2和S3线谱上，特征峰2 937 cm-1主要是纤维素中C-H键和C-H2的伸缩振动。图2中可以看出CC上该特征峰（2 937 cm-1）的信号很强，CML上较弱，而S1、S2、S3层上该信号更弱，完全被2 890 cm-1特征峰信号所覆盖。另外，图2中可以明显看出在CC线谱中1 598 cm-1的峰强度比2 890 cm-1高，而在S（次生壁）中1 598 cm-1的峰强度比2 890 cm-1弱很多。

图2a经谱线分析处理得到图2b—c。图2b比较了CC、CML和S23个形态区的拉曼光谱，从中可以看出2 890 cm-1特征峰的拉曼强度在S2线谱上最强，CML次之，CC拉曼强度最弱，说明S2纤维素浓度最高，而CC纤维素浓度最低，CML纤维素浓度介于S2和CC之间。另一特征峰1 598 cm-1的拉曼强度在CC线谱上最强，CML次之，而S2上的拉曼强度最弱，说明S2木质素浓度最低，而CC木质素浓度最高，CML木质素浓度介于S2和CC之间。这与木材细胞壁层中纤维素和木质素分布结果是相同的[18,25]，与黄藤材纤维细胞壁中木质素分布也是一致的[14-15]。

图2c比较了S1、S2和S33个形态区的拉曼光谱，从中可以看出2 890 cm-1特征峰的拉曼强度在S1、S2和S33个形态区域相差不大，说明这3个形态区纤维素的浓度相近，区别不明显。1 598 cm-1特征峰的拉曼强度以S1最大，S3次之，S2最小，说明这3个形态区之间木质素浓度以S1最大，S3次之，S2最小。

图2 谱线分析后纤维细胞平均拉曼光谱Fig.2 Average Raman spectra of fiber cells after line analysis

2.2 藤纤维拉曼成像分析

在显微镜下的试材横切面上选择具有代表性的纤维细胞，并对该细胞进行逐点扫描获得拉曼光谱。由于纤维素的拉曼光谱信噪比在2 890 cm-1处最大，能够得到较清晰的分布图像，而木质素的主要特征峰在1 598 cm-1处具有较好的信噪比，因此本研究选择在2 780～3 060（用C-H以及C-H2伸缩振动的空间分布规律来代表纤维细胞中纤维素的分布）、1 550～1 640（用苯环的对称伸缩振动的空间分布规律来代表纤维细胞中木质素的分布）以及1 026～1 195 cm-1（C-C和C-O-C伸缩振动的空间分布规律来代表纤维细胞中半纤维素的分布）3个振动区分别进行拉曼成像[22-24]，结果如图3所示。

图3a为选择的纤维细胞（如图中箭头所指），图3b—d分别为纤维细胞中纤维素、木质素、半纤维素的空间分布图。图3b的成像振动区主要特征峰是2 890 cm-1，是纤维素的C-H以及C-H2伸缩振动。在纤维细胞中可以明显地看出纤维素在S2的拉曼信号最强，说明此处纤维素的浓度最高，CML纤维素浓度次之，而CC纤维素的拉曼信号非常弱。图3中能看到相邻宽、窄两壁层之间对比亮度有差异，宽层比窄层亮，说明各壁层上的纤维素浓度不同，其中宽层的纤维素浓度高于窄层。

图3c的成像振动区主要特征峰是1 598 cm-1，是苯环的对称伸缩振动。纤维CC和CML的拉曼信号对比度很亮，其中CC最亮，而细胞其他壁层上的拉曼信号对比度很暗，说明纤维细胞上的木质素浓度在CC最高，CML次之，其他壁层上的木质素浓度都很低，与前人对木材及黄藤的研究结果一致[14-15，24]。S2、S3中没有明显的对比度差异，说明相邻次生壁层之间木质素浓度没有明显差异。

而图3d的成像振动区主要特征峰是1 090 cm-1，是重原子（C-C和C-O）的伸缩振动，对应的主要组分是纤维素、木聚糖、葡甘露聚糖。细胞中CC拉曼信号对比度很暗，CML次之，而S1的对比度最亮，S2和S3的对比度比S1稍暗，说明细胞中S1半纤维素浓度最高，S2和S3较低，CML和CC最低，这与木材细胞壁层中半纤维素分布结果相反，原因有待进一步分析[25]。此成像图中细胞壁的左右方向拉曼信号对比度明显比上下方向亮，这与图3b中的情况正好相反，即细胞壁上下方向对比度明显比左右方向亮。

图3 纤维细胞（a）与纤维细胞中纤维素（b）、木质素（c）、半纤维素（d）的分布图像Fig.3 Fiber cell (a), distribution of cellulose (b), lignin (c), and hemicellulose (d) in fiber cells

3 讨 论

纤维细胞次生壁中层木质素浓度最低，而细胞角隅木质素浓度最高，复合胞间层木质素浓度介于次生壁中层和细胞角隅之间，不仅与黄藤材纤维细胞壁中木质素分布是一致的[14-15]，而且与木材细胞壁层中木质素分布也相同[18,25]。此外，与黄藤材薄壁细胞角隅木质素浓度大于次生壁、复合胞间层木质素浓度大于次生壁中层的结论也具有一定相似性（黄藤材薄壁细胞木质素浓度为胞间层＞初生壁＞次生壁，而胞间层与初生壁合称为复合胞间层，说明复合胞间层木质素浓度大于次生壁）。此外，木质素浓度以次生壁外层最大，内层次之，中层最小。

尽管共聚焦拉曼光谱成像系统也存在一些不足，如对木质素只能分析其总量分布，而无法分别测定藤纤维细胞壁中不同的木质素结构单元即S型、G型和H型结构单元；传统共聚焦拉曼显微镜的针孔尺寸限制了共聚焦系统空间分辨率；此外，在进行物质的半定量化测试分析时还是存在一定的难度。但与利用可见分光光度计仅能对细胞壁木质素微区分布进行定性研究[12-14]相比，结合共聚焦拉曼光谱成像技术，不仅可以半定量化地系统研究细胞不同形态区域的木质素微区分布[15-16]，而且还可以对纤维素、半纤维素的微区分布进行测试，这也为通过研究棕榈藤不同生长阶段细胞壁主要成分的微区分布，探讨细胞壁成分的沉积过程，进而为构建棕榈藤材细胞壁结构模型提供理论依据。同时，应用拉曼光谱技术，可通过分析高地钩叶藤等劣质藤改性前后微观构造特征的变化，制定最佳材性改性工艺，实现劣藤优用的最佳效益[26]。此外，针对分辨率不高的问题，可通过形成光纤耦合共聚焦拉曼扫描显微镜来提高共聚焦分辨率和高光收集效率；或者通过时间门控方法，从时间维度剔除自发荧光、反射光和杂散光等信号的干扰，使得所成图像具有更好的信噪比和更高的分辨率；或者通过超分辨率图像复原技术对单个拉曼成像进行超分辨率图像恢复，达到高空间分辨率成像[27]。

总之，激光共聚焦扫描显微镜是集共聚焦原理、激光扫描技术和计算机图像处理技术于一体的新型显微镜，由于其具有非接触、高速测量及轴向层析成像等优点，随着科学技术的进一步发展，对其不断进行完善和更新（如结合可见分光光度计对不同的木质素结构单元进行区分测量），共聚焦激光扫描显微技术必将在更广泛领域中得到应用和推广[27]。

4 结 论

高地钩叶藤纤维细胞次生壁中层（S2）纤维素浓度最高，而细胞角隅（CC）纤维素浓度最低，复合胞间层（CML）纤维素浓度介于次生壁中层和细胞角隅之间，且纤维细胞次生壁内层（S3）、中层（S2）、外层（S1）3个形态区纤维素的浓度相差不明显。纤维细胞次生壁外层半纤维素浓度最高，中层和内层较低，复合胞间层和角隅最低。纤维细胞壁次生壁（S）木质素浓度低于复合胞间层（CML）。