基于体外鼠胚实验评估辅助生殖实验室质量*

特日格勒 爱伦高娃 格格恒 李秦宇琦 韩颖 马成

(赤峰学院附属医院生殖中心，内蒙古 赤峰 024000)

体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)是一项用于治疗不孕不育的医学前沿技术，这种人类辅助生殖技术虽然已被广泛应用于不孕症的治疗，但受孕率仍不尽理想[1]。IVF实验室就像一座“加工厂”，直接影响IVF结局，胚胎质量是判断辅助生殖技术成功与否的重要因素，体外培养的胚胎失去母体的自身保护，在没有任何保护屏障的情况下，对生存的微环境相当敏感，极有可能影响其生长发育潜能[2]。因此，在辅助生殖前，需要严格把控IVF实验室质量，全方位检测各个环节，建立稳定、可靠的培养体系，以确保为胚胎的生长发育提供相对稳定的场所。目前，鼠胚实验是监测IVF实验室各种培养液、实验耗材及实验设备质量的常用生物方法[3]，本生殖中心于2019年初完成胚胎实验室建立，并对其进行为期一个月的“热处理”[4]，之后进行雌鼠体内外受精和胚胎培养实验评估IVF实验室质量，旨在为临床IVF-ET提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雌性昆明系小鼠30只6周龄，体重20～22 g，SPF级健康雄性昆明系小鼠8只8周龄，体重30～33 g，购自北京北科华夏生物医药科技有限公司，使用许可证号SYXK(京)2017-0044，室温20～25℃，相对湿度40%～60%，12 h昼夜交替。本研究获得医院动物伦理委员会审核批准。

1.2 试剂和仪器 孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)购自杭州动物药品厂；卵裂液(CSC)、人输卵管液(Human tubal fluid，HTF)以及HEPES缓冲的人输卵管液(modified human tubal fluid，mHTF)购自欧文公司；人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)、洗精受精液、卵裂胚培养液G1和囊胚培养液G2购自瑞典Vitrolife公司；超净工作台购自美国Thermo公司；解剖显微镜购自日本Olympus公司；CO2恒温培养箱购自美国Bio-Rad公司；培养皿、试管等购自美国Falcon公司。

1.3 小鼠超排卵[5]用生理盐水将PMSG和hCG配成100 U/mL的溶液存于-20℃待用，培养液在使用前一天配制后置于37℃、6%CO2培养箱中过夜平衡。雌鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，48 h后腹腔注射hCG 10 U/只。

1.4 体外受精实验

1.4.1 采集卵母细胞[6]14只雌性小鼠腹腔注射hCG 16 h后，颈椎脱臼法处死，无菌环境下取出输卵管，用胚胎处理液和10% HSA清洗3次，在体视镜下用1 mL注射器刺破输卵管膨大部位，使卵子团释放，收集后转移至洗精受精液中，置于37℃、6% CO2培养箱培养。

1.4.2 采集精子并获能 颈椎脱臼法处死雄鼠，无菌环境下取出附睾尾，用胚胎处理液和10% HSA清洗3次，用镊子轻轻取出精子，收集后转移至含有洗精受精液的试管中，置于37℃、6% CO2培养箱中获能30～60 min。

1.4.3 体外受精 收集获能后的精子于一支新的试管中，取适量精子悬液加入至含有卵子团的洗精受精液中，置于培养箱中培养，4 h后，将卵子转移到另一新的含有洗精受精液的培养皿中继续培养。

1.5 体内受精实验 剩余的16只雌性小鼠腹腔注射hCG后，将雌雄小鼠按照2∶1的比例合笼，第二天清晨将出现阴栓的雌鼠颈椎脱臼法处死，无菌环境下取出输卵管，胚胎处理液和10% HSA清洗3次，在体视镜下用1 mL注射器刺破输卵管膨大部位，使合子释放，收集后转移至洗精受精液中，置于37℃、6% CO2培养箱培养。

1.6 原核及卵裂期胚胎观察与培养 培养第0天下午显微镜下观察原核合子形态；第一天上午观察2细胞期胚胎，之后将2细胞期胚胎转移至过夜平衡后的卵裂培养液中，置于37℃、6% CO2培养箱中继续培养；第二天上午观察4细胞期胚胎，下午观察8细胞期胚胎，并将8细胞期胚胎转移至过夜平衡后的囊胚培养液中，置于37℃、6% CO2培养箱中继续培养；第三天上午观察桑葚期胚胎；第四天观察早期囊胚；第五天上午观察囊胚。

1.7 统计学分析 采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，两组间比较采用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外受精结果 本次实验共进行20个体外受精周期实验，共获卵946枚，原核受精胚751个，受精率79.39%，2细胞数697枚，卵裂率92.80%，2细胞形成囊胚558个，囊胚形成率80.06%，见表1。

2.2 体内受精结果 共进行了14个体内受精周期实验，共获卵618枚，原核受精胚499个，受精率80.74%，2细胞数453个，卵裂率90.78%，2细胞形成囊胚368个，囊胚形成率81.24%，见表2。

2.3 两组小鼠胚胎体外培养结果 体内受精组和体外受精组相比，受精率、卵裂率和囊胚形成率组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 两组小鼠胚胎体外培养结果比较[n(×10-2)]Table 3 Comparison of in vitro culture results between the two groups of mouse embryos

2.4 小鼠胚胎形态观察 显微镜下观察不同发育阶段的小鼠胚胎，见图1。

图1 体外受精后不同发育阶段的小鼠胚胎(10×)Figure 1 Mouse embryos at different stages of development after in vitro fertilization

3 讨论

人类辅助生殖技术是治疗不孕不育的重要手段，其主要包括卵母细胞体外受精、胚胎早期体外培养和优质胚胎移植等过程[7]。但在IVF-ET过程中多个环节会影响胚胎质量，导致妊娠率降低，例如超促排卵、采卵或采精过程以及配子或胚胎培养过程中所使用的器皿和试剂等因素[8]。因此，实验室质量是辅助生殖技术成功的重要保障。由于小鼠胚胎的生长发育经历接近于人胚胎，因此鼠胚实验成为检测人早期胚胎体外生长发育环境的最佳模式，不仅能反应胚胎的发育潜能，还能检测实验室质量及实验人员的操作技能[9-11]。本研究通过检测体外鼠胚胎培养实验中的卵裂率和囊胚率，从而对本院建立的生殖胚胎实验室质量进行评估。

胚胎的生长发育受多种因素的影响，如温度、湿度、CO2浓度以及离子浓度等都会影响受精卵和早期胚胎生存发育[12-13]。研究表明，注射hCG后随受精时间的延长，优质胚胎率呈增高趋势[14]。生长激素预处理可明显提高卵巢低反应患者体外受精的结局[15]。本研究结果表明，体内获得的原核受精胚发育状况良好，体外获得的原核受精胚同样可发育至囊胚阶段，受精率、卵裂率和2细胞囊胚形成率两组间比较，差异均无统计学意义。虽然各指标偏低，但均符合人类辅助生殖实验室质控标准。本实验结果说明本院辅助生殖实验室的培养体系和技术员的操作水平已合格。通过对本研究中各周期的受精率和囊胚率分析，仍发现实验中多种因素影响胚胎形成和发育过程。从体内受精实验结果和体外受精实验结果数据分析发现，不同周期受精率、卵裂率和囊胚形成率波动较大，相对不稳定，我们猜测可能是由于实验过程中，频繁开关培养箱，造成培养箱内温度变化大，且CO2浓度在一定时间段内过低造成。研究表明，温度降低不利于胚胎生存[16]。另一方面，可能由于技术人员操作技术不娴熟，操作过程中培养皿离开温度稳定、饱和湿度的培养箱时间过长，造成胚胎渗透压改变，而渗透压对维持细胞的稳定生长至关重要[17]。此外，长时间的观察使胚胎体外曝光时间过长，而研究发现，光照影响胚胎的生长发育[18]，通过不断发现问题，解决问题，同时实验操作人员技术不断提高，受精率、卵裂率和囊胚形成率也在不断升高，但是不同周龄的小鼠或处于不同发情期的小鼠、卵泡液中微生物的存在、体质量等因素都是影响胚胎发育的关键，周龄较长则会造成精子和卵子质量下降，影响实验结果[19-21]。因此，在实验过程中严格把控实验条件和实验过程中所用到的试剂和仪器设置参数。

4 结论

鼠胚实验中多种因素影响受精率和囊胚形成率，因此不仅要严格控制影响胚胎生长发育的微环境，还要不断提高操作人员的技术水平，在鼠胚实验中任何细节都不容忽视，为建立具有合格的实验室质量控制体系和质量保障系统提供一定的参考价值。但胚胎质量受多种因素影响，如实验小鼠的品系、小鼠质量以及小鼠周龄等，总之，辅助生殖实验室必须建立完整系统的质量控制体系，以确保能够安全稳定运行。