化妆品中丁丙倍他米松的定性与定量分析

郝 彬， 李 薇

（上海交通大学药学院，上海 200240）

0 引 言

糖皮质激素（Glucocorticoids）具有抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克、非特异性抑制免疫及退热等多种作用，用于风湿性疾病、自身免疫病、严重感染或炎性反应以及过敏性疾病的治疗，同时也是皮肤科临床应用最广泛的外用药物之一［1］。因长期使用糖皮质激素会对人体造成严重危害，如引起激素依赖性皮炎、皮肤萎缩变薄及内分泌紊乱等毒副作用［2-4］，2015年版的《化妆品安全技术规范》将糖皮质激素列为化妆品禁用组分。但因糖皮质激素对皮肤具有显著的消炎祛痘、美白护肤功效［2］，部分厂商为了谋取利益仍然非法将其加到化妆品中，因此化妆品中检出各类激素的事件常有报道［5］。

我国自2010年开始实施国家标准《GB／T 24800.2-2009化妆品中四十一种糖皮质激素的测定》。2019年9月，国家药品监督管理局发布通告将《化妆品中激素成分的检测方法》和《化妆品中抗感染类药物的检测方法》纳入化妆品安全技术规范。为规避监管，一些新的糖皮质激素不断被合成和添加，而法定检验方法以及诸多化妆品中糖皮质激素检测方面的文献均是基于已知糖皮质激素标准品的液相-质谱联用检测方法［6-11］，虽然其检测范围不断拓展至80多种［12，19］，但仍无法覆盖所有的糖皮质激素衍生物，导致逃避监管的非法添加。

我们在日常检测中发现了一种检测标准之外的倍他米松类似物被非法添加到化妆品中，经过QTOF一级、二级质谱解析，与倍他米松的二级质谱比对和二级碎片裂解机理推断，并结合碱水解反应的结果，确定了该物质为倍他米松丁酸丙酸酯（无市售标准物质），同时根据水解产物倍他米松的检测确定其在化妆品中的含量。倍他米松属于长效、强效糖皮质激素类药物［13-14］，作用时间可持续36～54 h，是皮肤科常用的外用糖皮质激素类药物，也是化妆品中常添加的禁用物质［15］。除了国家标准中列出的倍他米松醋酸酯、戊酸酯及双丙酸酯，还可见丙酸酯［16-17］、双乙酸酯［16］、双戊酸酯［16］、硬脂酸酯［16］、苯甲酸酯［18-19］、丁酸乙酸酯［20］等诸多衍生酯。显然在缺少标准品情况下无法应用三重四极杆质谱或高分辨质谱进行准确的定性，更不可能进行定量检测。

本研究所建立的方法可应用于其他倍他米松衍生酯的检测，有助于解决该类激素可能逃避监管的各种新型、未知衍生酯的检测问题；为化妆品中非法添加糖皮质激素成分的高通量筛选和确认提供新的检测思路，有助于质监和药监部门对化妆品市场进行有效的监管。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：LC 30A超高压液相色谱仪（岛津）；X500R四极杆飞行时间质谱仪（Sciex）；Acquity UPLC超高压液相色谱仪（Waters）；Qtrap 5500三重四极杆质谱仪（AB Sciex）；5430R高速冷冻离心机（Eppendorf）；混合器（Eppendorf）；超声波发生器（上海安谱）；Milli-Q超纯水处理系统（Millipore）；固相萃取装置（CNW，上海安谱）；N-EVAP 112氮吹仪（Organomation Associates）。

试剂：甲酸（MS级，ThermoFisher）；甲醇、乙腈（HPLC级，Merk）；倍他米松、地塞米松（Macklin）；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg／3 mL，Waters）；待测化妆品试样（水样溶液，来自某化妆品代工厂家送检样品）。

1.2 对照品溶液的配制

分别准确称取适量倍他米松、地塞米松标准品，用甲醇分别配制成浓度为100 mg／L的标准储备液，根据需要逐级稀释成不同浓度的系列标准工作液。

1.3 待测样品溶液的制备

（1）提取和固相萃取（SPE）净化。取化妆品试样1.0 mL于15 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀，超声提取20 min，14 000 r／min离心10 min，收集上清液于15 mL聚丙烯塑料离心管中，于50℃水浴中氮气吹干后，加入3 mL 30%甲醇水溶液溶解残渣，所得溶液进行固相萃取。固相萃取柱依次用6 mL甲醇活化、6 mL水平衡后，将样品溶液过柱，先用6 mL 30%甲醇水溶液淋洗，再用6 mL 80%甲醇水溶液洗脱。SPE洗脱液于4℃下140 00 r／min高速离心10 min，取上清液进行液质分析或进行后续的碱水解反应。

（2）样品的碱水解。取20 μL SPE洗脱液于2 mL塑料离心管中，依次加入280 μL乙腈和0.1 mol／L NaOH溶液100 μL，涡旋10 s后置于Thermomixer中，25℃下600 r／min反应30 min，取样100 μL加入25 μL 0.1 mol／LHCl溶液，涡旋混匀，待液质分析。

1.4 定性分析条件

（1）LC 30A色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters）；流动相A为水溶液，B为乙腈，流速0.4 mL／min，柱温45℃，梯度洗脱程序：0～20 min，B相从20%线性升至65%；20～22 min，B相维持95%；22～22.1 min，B相从95%线性降至20%并保持至24 min。

（2）X500R质谱条件。离子源温度为550℃；帘气、辅助气1和辅助气2均为310.264 kPa；离子源电压为5.5 kV；正离子IDA扫描模式；质量扫描范围m／z 50～1 000；解簇电压为80 V；碰撞能量为35 V；数据采集处理软件：Sciex OS 1.6.2。

1.5 定量分析条件

（1）Acquity UPLC色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters）；流动相A为水溶液，B为乙腈，流速0.4 mL／min，柱温45℃，梯度洗脱程序：0～2 min，B相从20%线性升至30%；3～4 min，B相从30%线性升至95%；4～5 min，B相维持95%；5～6 min，B相降至20%。

（2）Qtrap 5500质谱条件。离子源温度：500℃；帘气、辅助气1和辅助气2均为310.264 kPa；离子源电压：5 kV；ESI＋模式下倍他米松多反应监测（MRM）条件：393.2→373.4，CE＝15；393.2→355.2，CE＝18；数据采集软件：Analyst 1.6.3，数据处理软件：MultiQuan 2.1.1。

2 结果与讨论

2.1 化妆品中未知糖皮质激素的定性分析

待测样品的总离子流图（见图1（a））中16.85 min质谱峰对应的一级质谱图提示m／z 519.274 3（见图1（b）），对应的分子式为C29H39FO7，并不在国标检测的41种糖皮质激素范围内。m／z 519.274 3的二级质谱碎片中出现m／z 393.204 2，与地塞米松、倍他米松的m／z一致，同时其他主要碎片离子，如m／z 337.178 4、319.168 3、291.173 9、279.173 7、277.158 6、263.142 4、185.096 0、171.081 2、147.080 1与地塞米松、倍他米松的碎片相同；仅有个别离子是特异性的，如m／z 115.039 0、411.215 3、87.043 2、71.047 3、57.033 4（见图1（c），图2）。因此可推测待测样品中的糖皮质激素为地塞米松或倍他米松的衍生物。

图1 待测样品的QTOF质谱图

图2 待测样品与倍他米松的二级质谱图比较

地塞米松和倍他米松是一对同分异构体，两者可达到色谱分离，保留时间分别为6.75和6.60 min（图3（b））。待测样品中的糖皮质激素经碱水解后产物保留时间为6.60 min（图3（a）），因此确定其为倍他米松酯。根据分子式C29H39FO7检索ChemSpider数据库可得到2个倍他米松衍生酯：戊酸醋酸倍他米松及丁酸丙酸倍他米松。

图3 待测样品碱水解后提取离子流图（a）及倍他米松、地塞米松标准品提取离子流图（b）

进一步分析待测样品二级质谱中的特异性碎片并总结其裂解规律（见图4），m／z 57.033 4对应于丙酸根，m／z 71.047 3对应于丁酸根，m／z 87.043 2对应于丁酸基团，m／z 115.039 0提示丙酸的结合位点在21-OH上，因此根据四极杆-飞行时间质谱的一级和二级数据可确定待测样品中的未知糖皮质激素为17-丁酸-21-丙酸倍他米松（丁丙倍他米松）。

图4 未知糖皮质激素的质谱裂解规律

2.2 酯类糖皮质激素的碱水解条件优化及定量

0.4%的NaOH水溶液、1.0%的Na2CO3水溶液和1.0%的LiOH水溶液均可水解倍他米松酯生成倍他米松，0.4%NaOH在30 min内可将丁丙倍他米松水解完全（见图5）。取系列浓度的倍他米松标准品按低浓度到高浓度连续进样，以被测物浓度（x）为横坐标，以相应的峰面积（y）为纵坐标计算标准曲线，y＝13 467x－4 862，R2＝0.997 9。将待测样品SPE的甲醇洗脱液经0.4%NaOH水解30 min后测定其中的倍他米松浓度为39.2 ng／mL，根据摩尔比和稀释倍数可计算得到未知样品中丁丙倍他米松的含量为310 ng／mL。

图5 丁丙倍他米松的水解时间曲线（以最大的峰面积为100%）

3 结 语

本研究首次应用碱水解和高分辨质谱鉴定了待测化妆品中非法添加的糖皮质激素-倍他米松丁酸丙酸酯，使用现有国家化妆品安全技术规范所列检测方法无法检出该激素。在无标准品情况下通过水解反应后对倍他米松的定量检测，确定了待测化妆品中丁丙倍他米松的含量为310 ng／mL。本研究可对化妆品中未知无市售标准品的酯类糖皮质激素进行快速定性、定量分析，从而有效检测药品、食品、保健品、化妆品中的非法添加，是对现有国家标准检测化妆品中糖皮质激素物质的有力补充。