水样中丙酰芸苔素内酯的检测方法研究

张慧心，于 丽

（山东中再生环境检测有限公司，山东 济南 250014）

1 丙酰芸苔素内酯及检测方法

1.1 丙酰芸苔素内酯

20 世纪90 年代中期，日本科学家高津户秀针对芸苔素内酯持效性进行了研究并取得了一系列成果[1]。并通过对不同芸苔素内酯类似物的合成，于1996 年筛选出2 种具有持效特性的BRs 品种：化合物Ⅰ和TS303，结构如图1 所示。从新型芸苔素内酯的结构看，2，3 羟基转化为丙酰基，这一特性在植物体内起到了延缓被酶降解的作用，因此达到使这两类新芸苔素内酯持效期延长的目的。目前使用最为广泛的持效芸苔素内酯为TS303，其由2，3 羟基酰化和22，23 位的羟基氧化而成，具有活性高、持效期长、药效释放稳定，提高植物抗逆、抗寒和抗旱，对作物增产效果显著等特点[2]。

图1 化合物I 和TS303 化学结构

1.2 水样中丙酰芸苔素内酯检测方法研究

我国是植物生长调节剂的生产大国和使用大国，由于前期对植物生长调节剂监管相对宽松，农业生产中所用到的含有植物生长调节剂类的农药，已经开始逐渐富集到人类赖以生存的水环境中，植物生长激素通过雨水的冲刷汇集到河流，通过灌水的下渗汇集到地下河中，现已严重威胁到水环境的安全[3]。由于水环境中一般情况下所含有的化合物物质种类较多且杂，而且不同性质的水基质效应差异非常大，所以，通常情况下对水样检测不仅要求稳定性要强，更重要的是灵敏度要高，从而对于水体检测的前处理过程，不仅要有较好的富集效果，还要有较好的净化效果。

2 实验部分

2.1 实验仪器

实验所涉及的仪器如表1 所示。

2.2 实验试剂及标准品

实验所涉及的试剂如表2 所示。

表2 实验试剂

标准储备溶液的配制：准确称取约10 mg（精确至0.01 mg）的丙酰芸苔素内酯标准品于100 mL 容量瓶中，用二氯甲烷溶解、定容至刻度后摇匀备用。内标储备溶液的配制：准确称取约10 mg 内标物于100mL 容量瓶，用二氯甲烷溶解，定容至刻度后摇匀备用。曲线标准溶液配制：将标准储备溶液和内标储备溶液1∶1 混合后以基质空白逐级稀释配制成一系列的曲线标准溶液。曲线标准溶液的质量浓度水平为1、2、5、20、50 μg/mL，所有的标准溶液均储存于4 ℃冰箱中，有效期为30 d。

2.3 样品前处理

准确量取100 mL 水样，加入10 mL 甲醇及1 mL内标溶液，充分混匀。依次以10 mL 甲醇和10 mL 水活化C18 固相萃取小柱，活化速度为5 mL/min。活化完毕后，水样以10 mL/min 流速通过C18 固相萃取小柱，上扬完毕后再以10 mL 水淋洗。最后用10 mL 二氯甲烷将固相萃取小柱中的丙烯芸苔素内酯洗脱至50 mL 茄形瓶中进行旋转蒸发浓缩。提取液在旋转蒸发仪器上以60 r/min 转速，真空度200 hPa，40 ℃水浴中旋转蒸发至近干，待SPE 净化。浓缩后的提取液采用炭氨基小柱净化，在小柱上装填约2 g 无水硫酸钠以去除可能的水分，以10 mL 二氯甲烷活化小柱，在液面消失前将平底烧瓶中的浓缩提取液以25 mL 二氯甲烷分3 次完全转移至小柱上，收集所有净化后的样品溶液于50 mL 的茄型烧瓶中，以上述相同的旋蒸条件浓缩至近干后以1 mL 二氯甲烷稀释，准备进行气相定量测定。

2.4 气相色谱分析

本方法采用气相色谱内标法进行定量分析，具体的仪器条件如表3 所示。

表3 色谱条件

3 结果与讨论

3.1 萃取方式的选择

目前水样分析常用的提取方式有液液萃取和固相萃取法，本研究选取制备的加标水样，通过实验对上述两种方法进行了萃取对比实验，并在同一气相条件下进行检测。实验结果显示，固相萃取的提取效率高于液液萃取法，这可能是基于C18 固相萃取小柱对丙酰芸苔素内酯的吸附能力较强，使水样在通过小柱丙酰芸苔素内酯能被很好的吸附，同时又在二氯甲烷洗脱下脱附。液液萃取的过程需要利用两种物质在不同溶剂中的分配系数差异，使丙酰芸苔素内酯从水相到萃取剂中，丙酰芸苔素内酯从结构看有一定的水溶性也易溶解在有机溶剂中，因此液液萃取的过程有所损失。因此，本研究选用提取效率更高的固相萃取法对水样中丙酰芸苔素内酯进行提取。

3.2 洗脱溶剂的选择及用量确定

丙酰芸苔素内酯易溶于大多数有机溶剂，实验过程中考察了甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷对丙酰芸苔素内酯的洗脱效果，结果表明，二氯甲烷的洗脱能力最强。除了洗脱液的种类会对实验结果产生影响，洗脱液使用的体积不同也会影响洗脱能力。

3.3 固相萃取小柱的选择及萃取方法确定

固相萃取包括液相和固相的物流萃取过程，固相对待测物的吸附力比溶解待测物的溶剂更大。当样品通过固相萃取小柱填料时，待测物会被吸附并浓缩在填料表面，其他组分则随着流动相排出。由于丙酰芸苔素内酯结构并非离子型，因此排除了离子交换性的固相萃取小柱。实验最后使用C18 小柱进行研究，目标物物在排出液中几乎无法检出，洗脱后的回收率90%以上，因此C18 固相萃取小柱被使用来萃取目标物。

4 方法验证

4.1 方法的线性相关性

本研究采用气相色谱内标法进行定量，通过对不含丙酰芸苔素内酯的水空白样品进行前处理净化后浓缩至近干的空白溶液中，加入丙酰芸苔素内酯及4.9041 μg内标，配置成1、2、5、20、50 μg/mL 的一系列基质标准溶液进行线性实验。进行定量分析，以标准品与内标质量比为横坐标，以标准品与内标峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，见图2。在水中丙酰芸苔素内酯质量浓度为0.01 μg/mL～0.5 μg/mL 范围内，标准曲线的线性回归良好，相关系数为0.999 5，回归方程为y=0.889 9x-0.038 5。该方线性相关性实验结果见表4。

图2 水样中丙酰芸苔素内酯方法线性标准曲线图

表4 水样中丙酰芸苔素内酯方法线性相关性实验结果

4.2 方法的检出限及定量限实验

方法检出限的定义为方法检出目标物的最低浓度，方法的检出限按照3 倍的噪音确定，以线性实验室每种农产品空白加标最低点0.1 μg/g 所对应的响应值进行计算，最终检出限折算至100 mL 样品中，结果为0.005 μg/mL。

4.3 方法的精密度和准确度

准确称取21 份不含丙酰芸苔素内酯的水空白样品，将空白样品分成3 组不同浓度水平，每个浓度水平7 个平行样品的加标回收率实验，添加水平分别为0.1、0.25、1 μg/g 来评估本方法的精密度和准确度，结果如表5。

表5 叶面肥中丙酰芸苔素内酯精密度和准确度实验结果

5 结论

本文开发并验证了一种对水样中丙酰芸苔素内酯的前处理方法。该方法简单、准确且有效地提取、净化后供后续气相色谱内标法进行定量分析。100 mL水样加入10 mL 甲醇及1 mL 内标溶液后以C18 固相萃取小柱进行萃取，再以二氯甲烷进行洗脱，洗脱液通过浓缩净化再浓缩后最终进行定量分析。本方法的检出限为0.005 μg/mL，定量限为0.01 μg/mL，精密度相对标准偏差为1.9%～2.7%之间，准确度平均回收率为91.1%～93.2%。在水中丙酰芸苔素内酯含量在0.01 μg/g～0.5 μg/g 范围内，标准曲线的线性回归良好，相关系数为0.999 5，回归方程为y=0.889 9x-0.038 5。