发酵乳中乳酸菌含量检测技术研究进展

赵 航

（巴东县公共检验检测中心，湖北巴东 444300）

我国食品安全国家标准GB 19302—2010[1]指出酸奶是以生牛羊乳或者乳粉为原料，经杀菌，接种嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵制成的产品。酸奶中的乳酸菌含量是衡量酸奶品质的一个重要指标，我国国家标准要求发酵乳中乳酸菌含量不得少于1×106CFU·mL-1。常见的市售发酵乳中添加的乳酸菌主要是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。嗜热链球菌为兼性厌氧或微好氧的革兰氏阳性球菌，是以两个卵圆型为一对的球菌连成长链状结构，在选择性培养基上会形成米色的两头尖尖的小菌落。保加利亚乳杆菌为兼性厌氧革兰氏阳性菌，在酸性环境下的菌体是粗长或者粗短的圆柱状，两端圆，在培养基上的菌落形态因培养基的种类和培养温度不同而表现出较大的差异。

1 发酵乳中乳酸菌含量的检测技术

1.1 平板培养技术

在食品安全检验领域检测发酵乳中乳酸菌的方法主要以国家标准方法（以下简称国标法）为主，国标法是依照微生物特有的生化特性，选取合适的培养基并给予适宜的培养环境，依据菌落特征对相应的菌落数进行计数。《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）[2]按照样品制备称取25 g 样品加入225 mL 无菌生理盐水中，取1 mL 混合液逐级稀释，选择2 ～3个适宜的连续稀释度各1 mL 加入无菌平皿中，分别倾注MC和MRS 琼脂培养基，倾注MC 的平板计数嗜热链球菌需要在36 ℃条件下培养72 h，计数中等偏小、边缘整齐光滑的红色菌落，菌落背面是粉红色。倾注MRS 的平板计数乳杆菌含量，于36 ℃条件下厌氧培养72 h，选取无片状生长，菌落数在30 ～300 的平板计数，依据标准中的计算方法算出乳酸菌的菌落数，以CFU·g-1为单位报告计数结果。

国标法检测乳酸菌数量的优点是步骤详细、操作性强、对人员计数要求低，但缺点是计数不准确、耗时长、操作烦琐以及工作量大，且目前已经无法满足企业生产的需求，与国际标准不接轨。

1.2 流式细胞技术

流式细胞技术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。2015年，国际标准化组织颁布了用流式细胞技术测定发酵产品中乳酸菌数量的方法标准，我国出入境机构也于2022年颁布了流式细胞技术检测发酵产品中乳酸菌的方法，即《乳及乳制品发酵剂、发酵产品中乳酸菌计数 流式细胞仪法》（SN/T 5436—2022）。该标准通过采用对原生质体、DNA 和膜电位3个参数进行染色的方法，观察活细胞相应参数的荧光强度变化实现对发酵乳中活性乳酸菌的计数。

流式细胞技术的主要原理是通过细菌内部的胞内酶可以特异性水解相关底物，将底物偶联上荧光染料，当底物进入活细胞内部后，胞内酶水解由流式细胞仪的激光器激发可以发出荧光，将待测菌悬液上样流式细胞仪，以单个微粒的形式通过检测器，每个微粒的荧光信号叠加，由荧光信号的强度精准计数菌悬液中微生物的数量。

流式细胞技术的检测步骤如下：制备1 ∶10 的样品均液，并以10 倍梯度逐渐稀释至1 ∶10 000，在其中加入缓冲液，荧光底物，反应30 min，超声波干扰离子后取100 ～200 μL 加入流式管中，上机检测。流式细胞仪可以检测500 ～20 000个/100 μL的微粒，因此在此过程中要注意选择合适的稀释梯度。杜耿记等[3]采用流式细胞技术测试了蒙牛乳业的5 款酸奶中的乳酸菌含量，并与标准方法进行了比较，结果表明流式细胞法可以准确快速稳定地检测酸奶中乳酸菌的含量，单个样品的检测时间仅为5 min，且和国标方法具有一致性。姜凯等[4]也建立了基于流式细胞技术的乳酸菌快速计数方法，通过实验优化了5(6)-羧基荧光素二乙酸酯和碘化丙啶（Propidium Iodid，PI）2种荧光染料的浓度和作用时间，探究了发酵乳样品的测试浓度，并优化了仪器的检测电压，最终得到了最佳的测试参数和效果，同样与现行国家标准方法有显著正相关关系。他们的研究对于流式细胞技术在发酵乳检测中的应用有积极影响，对货架期较短的非杀菌型发酵乳和其他活菌乳品生产企业的产品上市意义重大。

流式细胞检测技术在发酵乳检测中的应用具有明显的优势，检测时间短、前期处理加上检测时间仅需1 ～2 h，准确度和灵敏度高，但流式细胞仪设备较昂贵，对技术人员的要求也比较高，不利于在基层检测机构中推广应用。

1.3 荧光定量PCR 技术

荧光定量PCR 技术是基于荧光定量PCR 仪的一种检测目的基因有无及拷贝数的基础分子生物学技术。荧光定量PCR 技术在微生物鉴定上的应用主要是根据物种的特异性，针对每种微生物的特异性序列设计特异性的探针引物，提取物种DNA 后加入扩增酶和缓冲液，在体外荧光定量PCR 仪内实现目的基因的指数扩增，扩增目的片段的多少可以实时通过荧光染料或者探针荧光的积累被检测到。王绮等[5]用荧光定量PCR 技术定量检测了发酵乳中包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌在内的6种乳酸菌的含量，其准确度优于国家标准方法。

相较于前两种方法，荧光定量PCR 技术在对样品的前处理方面有较大优势，发酵乳的乳品基底干扰DNA 的提取，目前有专门针对蛋白含量高的食品样品DNA 提取试剂盒，价格不高且提取效果较好，获得浓度和纯度俱佳的DNA 是该技术的关键。目前发酵乳生产企业为了开发出具有丰富营养价值且口感良好的新产品，往往会在一种产品中添加多种乳酸菌，现有国家标准检测方法已经无法满足生产企业的实际需求，而荧光定量PCR 技术可以针对不同的菌种设计特异性引物探针实现对特定菌种的定性定量检测。

笔者认为可以开发多重的荧光定量PCR 技术，根据发酵乳的添加菌种，选择对应的扩增体系，结合三代数字PCR 技术和设备，真正实现对发酵乳样品高效准确的定量检测。

1.4 光谱学技术

光谱学技术因其具有高效无损的特点，在食品检测中的应用和研究也比较广泛。其中，原子吸收光谱法多用于检测各类食品中的金属元素。在微生物检测方面，光谱技术的应用还处于研究阶段，王绮等[5]基于近红外光谱和紫外吸收光谱技术开发了活菌饮料中乳酸菌的定量检测技术，通过优化前处理方法，建立定量分析模型，最终发现采用傅里叶变换近红外光谱建立的模型对乳酸菌活菌计数检测效果最佳。光谱检测技术具有高效、无损、便捷等优点，并且可以应用于现场无损检验，适合监督监管。但模型的建立较为复杂，需要专业人员进行操作，且食品样品基底复杂多变，推广上难度较大。

2 4种检测技术的优缺点比较

4种检测技术的优缺点具体见表1。每种技术各有优劣，但随着人们对食品安全和品质要求的提高，我国监管机构的监管能力也在进一步提升，检测领域的技术发展和人员的专业水平也在逐年提高，更加准确科学的检测技术必将取代传统技术。目前流式细胞技术在乳酸菌检测上已经有相关标准推出，期待新的技术进一步在相关检测上应用发展，为食品安全保驾护航。

表1 4种检测技术优缺点比较

3 发酵乳市场走向预测

乳酸菌不仅可以促进消化，调节肠胃，维持肠道菌群平衡，还有保健作用。在大健康时代背景下，人们对乳品质量的关注度逐渐增加，发酵乳作为人们的主要消费奶源，其也是将乳酸菌传递给人体的主要食品载体。目前发酵乳中较常见的乳酸菌有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，但随着发酵乳市场的活跃以及对益生菌研究的不断深入，一些优质的益生菌也被添加进发酵乳中，如鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌，干酪乳杆菌以及植物乳杆菌等，这些新菌种的加入丰富了发酵乳口感，提升了发酵乳的品质[6]。为了满足消费者需求，进一步引领发酵乳企业的良性发展，相关行业和部门应进一步加大发酵乳菌种资源的开发研究，并结合消费群体的年龄性格特征研发新产品。

4 结语

目前国家标准检测方法已经无法满足实际检测需求，基于分子生物学和细胞生物学的检测技术在天然活菌检测上具有显著的优势，相关学者已针对该类技术在发酵乳乳酸菌检验上的应用开展了相关研究工作，相信在政府相关部门的支持下该技术的广泛应用指日可待。