食管癌组织白细胞介素-6/信号转导子与转激活子3通路相关蛋白的表达及其与临床分期、分化程度的关系研究

谢宇，邓倩曦

作为常见的消化系统恶性肿瘤，食管癌已成为全球关注的疾病。有调查显示，在所有恶性肿瘤中，食管癌占比约为2%，其5年生存率仅为20%左右［1］。另有资料表明，全球范围内每年约有30万死于食管癌，其中我国死于食管癌的人群占比高达40%［2］，可知食管癌对我国居民的生命造成了极大的威胁。但是目前人们对食管癌的发病机制认识尚浅，且临床仍缺乏高效的抗肿瘤方案。有报道指出，影响食管癌预后的因素多，其中临床分期、分化程度是主要的危险因素［3-4］。但是影响食管癌临床分期、分化程度的因素仍需要进一步探讨。白细胞介素-6（IL-6）/信号转导子与转激活子3（STAT3）通路是恶性肿瘤细胞增殖、凋亡调控的重要途径，与食管癌、胃癌、肝癌等均紧密相关［5-8］。实验显示，对乳腺癌细胞进行基因干扰，可通过调控STAT3信号通路，下调磷酸化信号转导子与转激活子3（p-STAT3）水平增加细胞凋亡率、降低细胞存活率［9］。另有报道表明，对人食管癌细胞进行干预抑制IL-6/STAT3通路的活性，可通过下调二者的表达，降低p-STAT3水平，抑制B淋巴细胞瘤相关死亡启动子（Bcl-xl）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的活性提高其增殖抑制率和细胞凋亡率［10］。据此推测，IL-6/STAT3信号通路及其下游Bcl-xl、CyclinD1的表达可能参与食管癌的发生和发展。但该通路相关蛋白表达与食管癌临床分期、分化程度的关系尚未完全明确，仍需进一步探讨，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取绵阳市第三人民医院（四川省精神卫生中心）2018年10月至2020年7月收治的109例食管癌病人，男70例、女39例，年龄范围35～78岁，年龄（59.15±10.17）岁，临床分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期39例、Ⅲ期44例、Ⅳ期14例，肿瘤长径范围1.5～10.5 cm，肿瘤长径（5.52±1.05）cm，有淋巴结转移62例，病理类型：鳞癌98例（高分化18例、中分化59例、低分化21例）、腺癌8例（中分化3例、低分化5例）、小细胞癌3例（未分化3例）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 入选标准纳入标准：①均经病理学检查证实罹患食管癌；②均实施手术或活检，且均有癌组织、癌旁正常组织标本存档；③病人均对本研究知情同意。

排除标准：①手术或活检前1个月内接受相关抗肿瘤治疗者，如新辅助放化疗等；②复发性食管癌或转移性食管癌病人；③合并其他类型消化系统疾病者，如反流性食管炎等；④临床分期或分化程度等临床病理特征不明确者；⑤有意识障碍或精神障碍者。

1.3 方法IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1表达检测：采用免疫组化法检测癌组织和癌旁正常组织上述蛋白表达。待检测组织均有石蜡包埋，连续切片（层厚4 μm），脱蜡并利用梯度浓度酒精水化，然后采用压力锅进行抗原热修复。滴加鼠抗人IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1单克隆一抗工作液，需稀释200倍，尽可能覆盖组织，4℃孵育一抗过夜；滴加兔抗鼠IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1多克隆二抗工作液（以过氧化物酶标记），室温孵育二抗4 h。滴加显色剂，静置5～10 min后以蒸馏水终止反应。吹干并采用中性树胶封片，晾干后在高倍显微镜下阅片。染色程度：将无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0分、1分、2分、3分；阳性细胞率：将＜5%、≥5%且＜25%、≥25%且＜50%、≥50%且＜75%、≥75%分别记为0分、1分、2分、3分、4分。计算染色程度与阳性细胞率乘积，将结果为0、1～4、5～8、9～12者分别记为阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性表达［11］。

1.4 观察指标（1）对比癌组织和癌旁正常组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表达；（2）对比不同临床病理特征病人癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表达；（3）分析IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表达与临床分期、分化程度的关系。

1.5 统计学方法将SPSS 22.0软件作为统计学工具，单一样本计数资料例（%）对比采用配对资料χ2检验，两样本计数资料例（%）对比采用χ2检验，等级相关性采用Spearman分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁正常组织IL-6/STAT3通路相关蛋白表达癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白阳性表达率均高于癌旁正常组织，均差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。典型病例组织相关蛋白免疫组化检测结果见图1。

表1 食管癌109例癌组织与癌旁正常组织IL-6/STAT3通路相关蛋白阳性表达率对比/例（%）

2.2 不同临床病理特征病人癌组织IL-6/STAT3通路相关蛋白表达对比不同性别、老年与否、不同病理类型病人癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白阳性表达率对比均差异无统计学意义（P＞0.05）；Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤长径≥5 cm、有淋巴结转移、未/低分化病人癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白阳性表达率均分别高于Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤长径＜5 cm、无淋巴结转移、中/高分化病人（P＜0.05），见表2。

表2 食管癌109例不同临床病理特征病人癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表达对比/例（%）

2.3 癌组织IL-6/STAT3通路相关蛋白表达与临床分期、分化程度的关系癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表达与临床分期均呈正 相 关（r=0.81、0.83、0.79、0.72、0.71，P=0.010、0.007、0.005、0.018、0.023），与分化程度均呈负相关（r=-0.81、-0.79、-0.71、-0.70，P=0.011、0.019、0.023、0.038、0.040），“四格表”见表3。

表3 食管癌109例癌组织IL-6/STAT3通路相关蛋白表达与临床分期、分化程度“四格表”/例

3 讨论

食管癌的常见病因有遗传易感性、化学致癌物质接触、微量元素缺乏、维生素缺乏、烟酒刺激、热食热饮、口腔不洁等［12-13］。在食管癌中，基因突变所致的细胞增殖与凋亡调控因子水平异常，可使得细胞增殖与凋亡被打破，引发疾病发生和预后不良［14-15］。

本研究中显示癌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白阳性表达率均高于癌旁正常组织，提示食管癌的发生可能与IL-6/STAT3信号通路激活，使得二者蛋白表达及其下游的p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表达水平升高有关。IL-6属于一种多功能因子，在多种恶性肿瘤细胞中该因子有广泛的生物学活性，如食管癌、肺癌、结直肠癌等。有研究显示，IL-6可与其受体结合，其产物可激活胞质细胞外信号激活因子，促进STAT3表达并增加该蛋白的磷酸化水平［16］。STAT3属于信号传导与转录因子蛋白家族成员，可以被不同的细胞因子受体激活。有报道发现，食管癌组织中STAT3蛋白表达及p-STAT3水平均高于癌旁组织［17］，本研究与该报道相符，证实STAT3及其磷酸化水平很可能是食管癌发生的危险因素。Bcl-xl和CyclinD1均位于IL-6/STAT3通路的下游，前者属于凋亡抑制蛋白，可通过维持内环境、抑制细胞坏死等途径减少细胞凋亡，且该蛋白还被证实可参与多种蛋白质与蛋白质的相互作用进而抑制凋亡，如阻断线粒体外膜破坏、干扰死亡诱导信号复合体的组装、维持线粒体膜电位、控制活性氧自由基毒性发挥等［18］；后者是调控细胞周期G1期的特异性、关键性蛋白，而细胞周期是确保细胞进行生命活性的基本过程，CyclinD1蛋白表达可维持细胞生长和分裂，促进细胞增殖，相关研究表明CyclinD1蛋白对细胞增殖兼具内源性和外源性作用，也是促进恶性肿瘤发生和发展的关键分子［19］。因此IL-6、STAT3、p-STAT3、Bclxl、CyclinD1蛋白阳性表达很可能均参与食管癌的发生。

本研究还发现，食管癌组织中IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白阳性表达与临床分期、肿瘤长径、淋巴结转移、分化程度均有关，且相关性分析也证实上述蛋白表达与临床分期呈正相关，与分化程度呈负相关。IL-6/STAT3通路相关蛋白可通过多种途径促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，进而诱导细胞增殖与凋亡失衡，参与恶性肿瘤的发生。结合既往报道，推测IL-6/STAT3通路相关蛋白表达水平越高，促细胞增殖和抗细胞凋亡的作用越强烈，细胞的恶性潜能越高，因此可影响临床分期和分化程度［20］。

综上所述，食管癌组织中IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白阳性表达率高，且上述蛋白表达与临床分期呈正相关，与分化程度呈负相关，与肿瘤长径、淋巴结转移也均有关系。根据本研究结果与结论，推测可将抑制IL-6/STAT3通路的活性作为食管癌靶向治疗的新思路，但如何开发新药物并应用于临床应作为后期研究的重点。