中国荷斯坦牛PIK3CB基因多态性及其与繁殖和产奶性状的关联分析

2022-09-22 05:17徐昊祺许静漪胡丽蓉罗汉鹏张海亮刘巧香王雅春

中国畜牧兽医 2022年9期

徐昊祺，许静漪，胡丽蓉，张帆，罗汉鹏，张海亮，师睿，李想，刘林，刘巧香，郭刚，王雅春

(1.中国农业大学动物科技学院，农业农村部动物遗传育种与繁殖(家畜)重点实验室，畜禽育种国家工程实验室，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京生物种业创新联合体，北京 101206；4.北京首农畜牧发展有限公司，北京 100029)

长期以来，育种者对奶牛的产奶性能进行了高强度的选育，其遗传进展取得了一定程度的改善[1]。然而，由于产奶性状与繁殖性状之间存在的不利遗传相关，产奶性状的高强度选择造成了繁殖、健康、长寿等功能性状的衰退，严重影响了奶牛养殖的效益[2]。由于繁殖性状的遗传力较低，常规选育进展速度较慢；针对繁殖性状进行相关研究，筛选候选基因和分子标记，采用分子标记进行辅助选择对繁殖性状的遗传改良具有重要意义。师睿等[3]前期对中国荷斯坦牛繁殖性状进行了全基因组关联分析，获得了包含磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚单位β(PIK3CB)在内的多个候选基因。随后，采用蛋白互作网络分析发现PIK3CB基因与多个候选基因存在互作关系，表明PIK3CB基因可能是影响中国荷斯坦牛繁殖性状的重要基因(未发表)。PIK3CB基因可以编码磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号转导通路中磷脂酰肌醇3-激酶的p110催化亚单位PI3Kp110β[4]，PI3K/Akt通路广泛存在细胞中，对细胞周期、凋亡、糖代谢及其他重要生理过程产生调节作用[5]。

研究表明，PI3K/Akt通路可调节奶牛等哺乳动物颗粒细胞的凋亡进程，参与卵泡发育和排卵，以调控卵巢活动周期[6-7]。畜禽生殖器官的细胞凋亡与繁殖性能存在关系，在雌性动物卵巢中，卵母细胞、颗粒细胞和黄体细胞的凋亡会使卵泡闭锁，从而影响卵巢发育[8-9]。排卵后残留的颗粒细胞和膜细胞形成黄体，黄体的正常退化是启动下一个发情周期和卵泡发育的重要条件，黄体的溶解也同样与细胞凋亡有密切联系[10]。输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞的周期性生长、分化、退化和再生与生殖周期有密切联系；在不同繁殖力的母羊生殖器官中，细胞凋亡情况和细胞凋亡基因Bad的表达存在显著差异，Bad基因编码PI3K/Akt通路下游Bcl-2家族中的促进细胞凋亡蛋白，受上游PIK3CB基因表达的调控[11]。马鸿程等[12]发现，在牦牛不同大小级别卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中均有PIK3CB基因表达，其参与了PI3K/Akt介导的卵泡发育调控。上述研究表明PIK3CB基因可能在动物繁殖生理中扮演着重要角色。此外，PI3K/Akt通路通过调控葡萄糖摄取和脂质合成，参与奶牛乳腺上皮细胞的功能分化和乳汁合成的代谢途径[13]。葡萄糖是泌乳奶牛合成乳糖的前体物质，与乳脂、乳蛋白的合成密切相关，对泌乳奶牛具有重要的营养生理功能[14]。同时，乳糖可以维持牛奶的渗透压，其合成速率是产奶量的主要控制因素[15]。在敲除PIK3CB基因的小鼠肝脏中，p110β的缺失会影响胰岛素敏感性和葡萄糖稳态[16]。PI3K/Akt通路上游PIK3CB基因参与表达的PI3K蛋白受胰岛素受体激活后催化4，5-二磷酸脂酰肌醇(PIP2)生成第二信使PIP3，可以调控糖原合成、抑制糖异生，降低血糖[17]，从而影响奶牛的产奶性能。

综上，PIK3CB基因可能与中国荷斯坦牛繁殖和产奶性状有关，但在荷斯坦牛中鲜见关于PIK3CB基因多态性与繁殖和产奶性状的关联分析。本研究拟通过筛查PIK3CB基因的单核苷酸多态位点(SNP)，并与荷斯坦牛的5个繁殖性状(初产日龄、初配日龄、产犊至首次配种间隔、青年牛首末次配种间隔、经产牛首末次配种间隔)和6个产奶性状(产奶量、乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量、乳脂率、体细胞评分)进行关联分析，以探究该基因与荷斯坦牛繁殖和产奶性状的关系，获得中国荷斯坦牛繁殖和产奶相关的遗传标记，为中国奶牛的标记辅助选择和基因组选择提供有用信息。

1 材料与方法

1.1 DNA混池构建

选取70头无亲缘关系或亲缘关系较远的中国荷斯坦牛公牛构建DNA池，冻精样品由北京奶牛中心提供。用高盐法提取冻精样品基因组DNA，使用NanoDrop 2000检测浓度后将所有DNA稀释到100 ng/μL，于-40 ℃保存备用。

1.2 样品采集和DNA提取

挑选北京地区8个牛场(金银岛、半截河、南三、渠头、长三、长四、金星和中以)1 160头健康的泌乳荷斯坦牛，采集血液样品，每头牛采集尾根静脉血约10 mL，使用血液基因组DNA提取试剂盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)从抗凝血样提取基因组DNA，利用NanoDrop 2000测定样品DNA浓度和纯度，并通过2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段完整性，―40 ℃保存备用。

1.3 基因多态性筛查

根据GenBank中牛PIK3CB基因的序列(登录号：NC_037328.1)，采用Primer-BLAST设计引物，引物信息见表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反应体系25 μL：DNA(100 ng/μL)1 μL，1×CataAmpTaqPlus PCR Mix(北京开拓赛思生物技术有限公司)22 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各1 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，退火(温度见表1)30 s，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃延伸1 min。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶检测后，送至北京擎科生物科技有限公司测序，利用R语言对测序峰图进行可视化，识别双峰，并比对参考序列筛选SNP位点。

表1 引物信息

续表

1.4 基因分型

针对筛选出的SNP，根据其峰值比例、距离、所处区域及突变类型等确定了7个SNPs用于在1 160头泌乳荷斯坦牛中进行基因分型。采用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术进行SNP分型，其检测引物和通用引物见表2，KASP分型由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司完成。

表2 多态位点竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分型引物信息

1.5 育种值估计

本研究收集了北京地区荷斯坦牛群(与基因分型个体属于相同群体)的初产日龄(AFC)、初配日龄(AFS)、产犊至首次配种间隔(ICF)、青年牛首末次配种间隔(IFL_H)、经产牛首末次配种间隔(IFL_C)5个繁殖性状以及产奶量(MY)、乳蛋白量(PY)、乳蛋白率(PP)、乳脂量(FY)、乳脂率(FP)、体细胞评分(SCS)6个产奶性状的估计育种值(EBV)作为表型，用于关联分析。基于牛群的生产性能测定记录和牧场管理记录，进行上述性状的常规遗传评估工作，进而获得上述性状的估计育种值，繁殖和产奶性状的遗传评估模型参考Liu等[18]和任小丽等[19]的研究。

1.6 数据处理与统计分析

对7个SNPs进行分型后，统计具有多态位点的基因型频率、基因频率、多态信息含量(PIC)、群体杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，并检验各SNP基因型分布是否符合哈代-温伯格平衡定律。使用Haploview 4.2软件对PIK3CB基因SNP进行连锁不平衡分析，并构建单倍型块。

采用SAS 9.2软件的GLM过程对5个繁殖性状(AFC、AFS、ICF、IFL_H和IFL_C)和6个产奶性状(MY、PY、PP、FY、FP和SCS)与PIK3CB基因的7个SNPs进行基于单位点和单倍型组合的关联分析，关联分析模型为：

Y=μ+G+e

式中,Y,泌乳牛各繁殖或产奶性状的EBV;μ,群体均值;G,基因型或单倍型固定效应;e,随机残差。采用Bonferronit检验进行组间比较。结果以最小二乘均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 PIK3CB基因的SNP

根据双峰筛查与序列比对，确定了17个位于1号染色体上的候选SNPs位点(表3)，均已被数据库收录，其中15个SNPs位于内含子区域，2个SNPs位于外显子区域。最终确定7个SNPs用于在泌乳牛群体中分型，其测序峰图如图3所示。由图3可知，g.130430832 A>-位点可见由缺失导致的片段错位，其余SNP位点可见明显套峰。

表3 PIK3CB基因候选SNPs信息

箭头所示为SNPs位点

2.2 SNP的群体遗传学分析

通过KASP分型技术，本研究在1 160头泌乳荷斯坦牛中获得了7个SNPs的基因型，部分结果如图3所示。由图3可以看到3种基因型聚类明显，说明SNP分型结果可靠。

左上和右下区域点分别代表纯合基因型；中间区域点代表杂合基因型；圆圈中点代表无明确分型的信号；左下区域点为空白对照

由表4可知，PIK3CB基因7个SNPs的MAF的范围为0.12～0.44。位点g.130430832 A>-、g.130433743 A>G和g.130448069 G>A的PIC分别为0.21、0.23和0.22，为低度多态；其余SNP的PIC位于0.41～0.49之间，为中度多态。g.130448069 G>A位点处于哈代-温伯格不平衡状态(P<0.05),其余SNPs均处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。7个SNPs的遗传杂合度(He)较低，说明其在测定群体中变异较小。g.130430832 A>-、g.130433743 A>G和g.130448069 G>A位点的有效等位基因数(Ne)较小，等位基因在测验群体中分布较不均匀，其余SNPs均接近于2，说明等位基因在测验群体中分布均匀。