河北省奶牛源大肠杆菌的分离鉴定、致病性及中草药体外抑菌效果研究

邵明珠，赵允清，李松励，侯绍华，张艳英

(1.河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛066604；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

近年来，大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)感染引起人们的广泛关注，其主要破坏肠道菌群平衡，改变正常肠道形态，引发炎症反应，使幼龄动物的生长速度下降。而奶牛源大肠杆菌是引起犊牛腹泻、奶牛乳房炎、子宫内膜炎的主要病原菌之一[1-3]。通常在犊牛出生后第1周极易感染腹泻。据报道，在法国，3日龄至1月龄奶牛的死亡率分别为5.6%和5.7%，而在美国则超过6.9%[4]，在大环境饲养中犊牛腹泻发病率为90%～100%，病死率高达30%[5]。2017年，黑龙江地区犊牛腹泻大肠杆菌检出率为100%[6]；2018年，山东地区犊牛腹泻大肠杆菌检出率为100%[7]。因此，大肠杆菌感染引起的犊牛腹泻严重制约奶牛行业的发展。

目前，针对大肠杆菌引起的犊牛腹泻、奶牛乳房炎、子宫内膜炎的治疗主要以抗生素为主，但抗生素的高使用率和不规范使用使细菌产生严重的耐药性[2]。研究证实，在大肠杆菌分离株中存在1类整合子、超广谱β-内酰胺酶(ESBL)、C类β-内酰胺酶(AmpC)和质粒介导的喹诺酮类(quinolones)耐药基因，增加了治疗的困难[8]。为解决当前耐药性问题，中草药因具有价格低、毒性小、不良反应少、不易产生耐药性等优点成为替抗药物的选择之一，且中草药中的某些成分具有抗菌、抗病毒的能力[9-10]。据报道，大黄提取物中的大黄素(emodin)对大肠杆菌具有较好的抑菌作用，可以改善肠道微生物菌群，提高动物免疫力[1]；中草药苦参、决明子、白头翁、蒲公英和黄柏醇提取液对大肠杆菌具有较好的抑菌作用[11]。在病毒研究中，菜籽提取物菜籽皂甙具有抗猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的作用，可抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)诱导的细胞凋亡(apoptosis)，并能通过降低宿主细胞基因的表达有效抑制PRRSV的复制[12]。河北省是养牛大省，是中国肉牛主产区之一，而奶牛源大肠杆菌是一种易发的环境性致病菌。本研究为分析河北省奶牛场大肠杆菌流行株特点，对分离菌株进行了致病性研究，并筛选出抑菌效果较好的单味及复方中草药，为奶牛腹泻临床中草药防治提供了一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 于2020年10月从河北张家口、衡水武邑及桃城区采集30份奶牛粪便样品，奶牛表观消瘦、腹泻。

1.1.2 培养基及主要试剂 麦康凯培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；伊红美兰培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母粉、胰蛋白胨均购自上海畅硕生物科技有限公司；琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司；氯化钠购自成都市科龙化工试剂厂；无水乙醇购自国药集团化学试剂北京有限公司；2×EsTaqMasterMix购自生工生物工程(北京)股份有限公司；DNA提取试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司；生化鉴定试剂盒购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；血清鉴定试剂盒购自广州欧边生物制品有限公司。

1.1.3 中草药 五味子、五倍子、乌梅、夏枯草、百里香、石榴皮、丁香、肉桂、藏药蓝花荆芥均购自河北保定安国中草药市场。

1.1.4 试验动物 8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司，体重20 g±2 g，饲养温度控制在23 ℃±2 ℃，环境湿度控制在50%±10%，进行12 h光照及12 h黑暗循环，饲喂无菌的饮水与饲粮。所有程序均按照国际公认的原则及中国关于实验动物使用和护理的法规进行。

1.2 方法

1.2.1 分离菌株形态学鉴定 将样品处理后，用无菌接种环蘸取少量样品，在伊红美兰培养基中进行4区划线，将培养基置于37 ℃恒温培养箱内培养12 h，观察菌落大小、颜色、形态特点；用接种环挑取目标单个菌落4区划线接种麦康凯培养基中，将培养基置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，观察菌落颜色、大小、形态特点。将分离纯化的细菌保存于甘油中，―80 ℃保存备用。

1.2.2 分离菌株生化培养鉴定 对疑似奶牛源大肠杆菌的样品进行编号，为A1～A12。取1条生化鉴定试剂管，用酒精擦拭表面进行消毒，从营养琼脂平板挑取单菌落至无菌生理盐水中仔细研磨制成均一细菌菌悬液，每孔加入100 μL菌悬液，接种完后做好标记，盖上盖子，置于37 ℃培养箱培养24 h，不同检测对象加入不同的反应试剂，放在记录卡上观察。

1.2.3 分离菌透射电镜鉴定 取制备好的菌液1 mL，2 000 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL PBS将沉淀进行重悬，2 000 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL PBS，进行复染。

1.2.4 分离菌株血清型鉴定 取洁净载玻片1张，取已知血清1滴滴于载玻片一端，另一端滴生理盐水1滴做对照。取被检细菌少许，置生理盐水水滴与血清中进行混匀，参考标准观察结果。

1.2.5 分离菌株PCR鉴定 根据GenBank中O157大肠杆菌ECI-1717基因序列(登录号：EU871626.1)的保守片段，利用Primer Premier 5.0软件分别设计2对引物，引物序列见表1。引物均由金唯智生物(北京)科技有限公司合成。参考DNA提取试剂盒说明提取部分纯化菌株的DNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 引物信息

1.2.6 分离菌株致病性研究 将分离菌株接种于营养肉汤培养基中，37 ℃、180 r/min恒温摇床培养，每间隔30 min测定D600 nm值。将小鼠分为试验组与对照组，试验小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，对照组小鼠注入等量的生理盐水，6 d内观察小鼠临床症状、发病及死亡情况，剖检小鼠观察病理变化。

1.2.7 中草药提取液的制备 传统煎煮法：称取中草药20 g，加蒸馏水200 mL，浸泡2 h，武火加热煮沸后改文火煎煮30 min，用12层纱布过滤，留存煎煮液；向药渣中加入150 mL蒸馏水，同样的方法煎煮，过滤弃药渣；合并2次煎煮液，4 500 r/min离心20 min，将药物进行加热浓缩为20 mL，浓度为1 g/mL，121 ℃高压灭菌，4 ℃保存备用。

醇提法：称取中草药20 g，加入200 mL 70%乙醇溶液，浸泡10 h，80 ℃水浴加热2 h，12层纱布过滤；药渣加入100 mL 70%乙醇溶液，80 ℃水浴加热1 h，经12层纱布过滤；合并2次滤液，4 500 r/min离心20 min，80 ℃下进行旋转蒸发浓缩，浓缩为20 mL，浓度为1 g/mL，4 ℃保存备用。

1.2.8 单味中草药最小抑菌浓度及最低杀菌浓度测定 采用96孔板-二倍稀释平板法测定最小抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)，96孔板每孔加入100 μL LB液，第1孔内加入100 μL中草药提取液，依次进行2倍稀释，稀释1～10孔，药物浓度依次为500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.80、3.97、1.98、0.99 mg/mL，1～10孔内加入1×108CFU/mL菌液10 μL，第11孔不加药物为阳性对照，第12孔不加细菌为阴性对照，做2组重复。将96孔板放入37 ℃恒温培养箱内培养24 h，观察结果。在阳性对照孔内出现浑浊、阴性对照孔内不出现浑浊的前提下，1～10号孔内液体澄清透明的最小药物浓度视为药物对菌株的MIC。在测定MIC基础上，吸取100 μL澄清液体分别涂在琼脂培养基上，将培养基置于37 ℃恒温培养箱培养8 h观察结果，培养基上无细菌生长的药物最低浓度则为该药物对菌株的MBC。

1.2.9 6种中草药联合用药 首先，根据中兽医理论辩证观点，通过疾病临床表现，综合分析，按照中兽医的诊断思路泄泻病症进行辩证；其次，根据中草药具体药理性质及各单味药之间的相须、相使、相畏、相杀原理，以及中兽医理论整体观念和辩证论治观点，将药物进行组合，以提高中草药之间的作用功效。

2 结 果

2.1 分离菌株形态特点

在麦康凯琼脂平板上形成单个菌落呈粉红色，菌落直径1 mm左右，菌落圆形、隆起、湿润、光滑、边缘整齐(图1A)；在伊红美兰平板上生长出单个菌落，中心呈黑色带金属光泽(图1B)。

图1 麦康凯培养基(A)、伊红美兰培养基(B)菌株生长结果

2.2 分离菌株生化鉴定结果

通过生化鉴定管说明标准进行判断，其中葡糖糖、麦芽糖、甘露糖、吲哚试验、M.R试验均为阳性，V-P试验为阴性(表2)，符合大肠杆菌生化特点，证明分离菌株为奶牛大肠杆菌。

表2 分离菌株生化鉴定结果

2.3 分离菌株电镜结果观察

电镜结果可以看出，分离菌株两端钝圆、杆状菌、无鞭毛、菌毛，大小为0.5～0.8 μm(图2)，确定为大肠杆菌。

图2 分离菌株电镜结果(7 000×)

2.4 分离菌株血清型鉴定结果

奶牛源大肠杆菌菌株血清型鉴定结果显示，样品A1～A7血清型为O55∶K59(B5)，为优势血清型，检出率为58.3%，A8～A12血清型分别为O128∶K67(B12)、O44∶K74(L)、O28∶K73、O11∶K58(B4)、O114∶K90(B)(表3)。

表3 分离菌株血清型鉴定结果

2.5 分离菌株PCR鉴定结果

对部分分离菌株进行PCR扩增，结果显示，在约500、1 392 bp处可见与预期大小一致的单一条带(图3)。

M，DL2000 DNA Marker;1，阴性对照；2～6，菌株A1、A8、A9、A10、A11

2.6 分离菌株感染小鼠临床症状及致病性结果

将制备好的菌液腹腔注射小鼠，主要临床症状表现为精神沉郁、呼吸急促、蜷缩、行动迟缓，眼睛周围有白色脓性分泌物，粪便不成形，有黏肛现象；病理变化表现为肠壁变薄、鼓气、出血，肠道内有大量黄色内容物产生，肠道正常形态发生改变，肝脏出血，脾脏无肿大，但出血严重。

2.7 单味中草药MIC测定结果

不同中草药提取液对奶牛源大肠杆菌的MIC测定结果见表4。由表4可知，在水提取液中，五倍子、五味子抑菌效果最好，MIC值均为7.80 mg/mL；乌梅、夏枯草、石榴皮、百里香抑菌效果次之，MIC值在15.63～31.25 mg/mL之间；藏药蓝花荆芥抑菌效果最差，MIC为125 mg/mL；肉桂、丁香水提取液无抑菌效果。在醇提取液中，五倍子抑菌效果最好，MIC值为3.97 mg/mL；五味子、石榴皮、乌梅抑菌效果次之，MIC值在7.80～15.63 mg/mL之间；百里香、夏枯草、丁香抑菌效果较差，MIC值均为31.25 mg/mL；肉桂、藏药蓝花荆芥抑菌效果最差，MIC值均为125.00 mg/mL。表明五倍子醇提取液抑菌效果最好；石榴皮醇提取液比水提取液抑菌效果好，肉桂与丁香水提取液无抑菌效果，但醇提取液有抑菌效果。

表4 中草药MIC测定结果

2.8 单味中草药MBC测定结果

不同中草药提取液对奶牛源大肠杆菌的MBC测定结果见表5。由表5可知，在水提取液中，五倍子和五味子抑菌效果最好，MBC值均为7.80 mg/mL；乌梅、夏枯草、石榴皮、百里香抑菌效果次之，MBC值在15.63～62.50 mg/mL之间；藏药蓝花荆芥抑菌效果最差，MBC值为250.00 mg/mL；肉桂、丁香水提取液无抑菌效果。

表5 中草药MBC测定结果

在醇提取液中，五倍子抑菌效果最好，MBC值为3.97 mg/mL；五味子、石榴皮、乌梅抑菌效果次之，MBC值在7.80～15.63 mg/mL之间；夏枯草、丁香、百里香抑菌效果较差，MBC值在31.25～62.50 mg/mL之间；肉桂、藏药蓝花荆芥抑菌效果最差，MBC值分别为125.00和250.00 mg/mL。

2.9 6种中草药联合用药对大肠杆菌的抑菌效果

6种中成药联合用药结果见表6。由表6可知，五味子和乌梅联合用药抑菌效果最好，IZD为26.00 mm，MIC、MBC均为3.97 mg/mL；五倍子和乌梅抑菌效果较好，IZD为23.66 mm，MIC、MBC均为7.80 mg/mL；百里香+蓝花荆芥和夏枯草+蓝花荆芥抑菌效果最差，IZD分别为13.00和13.33 mm，MIC、MBC均为62.50 mg/mL。

表6 中草药体外联合用药抑菌效果测定

3 讨 论

大肠杆菌是引起犊牛腹泻、奶牛乳房炎、子宫内膜炎的主要病原菌之一，影响奶牛存活数量，改变牛奶质量和产奶量，使奶牛生殖性能受损、扑杀率不断增加，严重制约奶牛行业的发展[2]。本研究分离菌株通过透射电镜观察、生化鉴定、血清型分析及PCR鉴定为大肠杆菌。血清型测定结果为O55、O128、O44、O28、O11、O114型，其优势血清型为O55型，与王国华[13]报道的泰安地区奶牛粪便中大肠杆菌血清型检测为O128、O44、O28型，方光远等[14]报道的南京地区犊牛腹泻大肠杆菌血清型检测为O15、O26、O36、O78、O35型存在一定的差异性，表明不同地区奶牛源大肠杆菌O抗原血清型可能存在地区性差异，因此应对不同地区奶牛源大肠杆菌病的发病情况采取不同的防控措施。

近年来，大肠杆菌耐药基因已普遍存在并呈现增加趋势，已证实大肠杆菌耐药基因可在菌株之间发生垂直传播，并通过质粒、转座子、整合子进行传播[15]。据调查发现，大肠杆菌对多种抗生素具有耐药性，尤其对β-内酰胺酶类、氟喹诺酮类药物的耐药性极其严重，是大肠杆菌感染治愈率低的主要原因之一[16]，在替代抗生素治疗及减少耐药性的产生中，中草药一直是人们研究的重点对象，其含有多种有效成分，如碱类(alkaloid)、萜类(terpene)、单宁(tannin)、皂苷(saponin)、黄酮类(flavonoids)，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[17]。本研究通过2种中草药提取方法对单味中草药抑菌效果进行测定，结果发现存在以下几种情况：①中草药醇提法抑菌效果优于传统煎煮法，如五倍子、石榴皮、丁香、肉桂，其中五倍子醇提法抑菌效果最优，与Wang等[18]研究的五倍子醇提取液抑菌效果达到100%结果相一致，究其原因可能是，一方面，不同提取方法、提取物的物质组成不同，其性质也存在一定的差异性，另一方面，五倍子水提取液中含有一些水溶性成分和少量的脂溶性成分、糊化淀粉、蛋白质等，降低了五倍子的效果[2，19]；石榴皮醇提取液抑菌效果优于水提取液抑菌效果，且两种提取方法抑菌效果差异较大，与洪军等[20]证实的石榴皮醇提取物抑菌效果优于水提取物结果相一致，据调查发现，石榴皮中主要含有鞣质类、黄酮类和有机酸类物质，其中鞣花酸醇提法获得率最高可达0.049 mg/g[21]，因此可使药物发挥较好的效果；丁香与肉桂醇提法具有抑菌效果，水提法丁香、肉桂无抑菌效果，原因主要与丁香、肉桂所含成分有关，其主要含有丁香酚、肉桂醛等挥发性成分，在传统煎煮法中易使有效成分挥发掉，不利于有效成分的保留，据Prabuseenivasan等[22]研究丁香精油与肉桂精油对大肠杆菌的抑菌效果发现，丁香精油MIC为1.6～6.4 mg/mL，肉桂精油MIC为0.8～3.2 mg/mL，抑菌效果较显著。②醇提法与传统煎煮法提取同一种药物的抑菌效果相同，如五味子2种提取方法均具有较好的抑菌效果，据调查发现，五味子属于广谱抑菌药物，可以改变大肠杆菌细胞膜的通透性，从而影响菌株线粒体内膜及细菌的能量代谢和蛋白质的合成，因此五味子具有较好的抑菌效果[23]。③水提取法抑菌效果优于醇提取法，如夏枯草主要含有一些萜类及黄酮类化合物，属于水溶性成分，传统煎煮法更有利于药物成分的保留，王放银等[24]研究夏枯草传统煎煮法对大肠杆菌的抑菌效果表明，IZD为10.22 mm，MIC为1.2 mg/mL，因此，夏枯草传统煎煮法具有较好的抑菌效果。在药物联合用药中，五味子与乌梅抑菌效果最优，抑菌直径为26.00 mm，MIC、MBC均为3.97 mg/mL，乌梅与五味子联合用药表现出协同作用，原因如下：①乌梅性平，归肝、脾、肺、大肠经，具有敛肺、涩肠、生津作用，临床中常用于治疗久泻久痢，其含有多种有机酸成分，可抑制细菌的生长；②五味子性温，归肺经、心经、肾经，具有收敛固涩、益气生津的作用，属于敛肺涩肠药，临床中常用于治疗久泻不止，其主要含有木质素，具有抗菌作用，因此，乌梅与五味子联合用药可使药效不断增加，发挥出较好的抑菌效果。本研究对单味及复方中草药进行体外抑菌效果筛选，为这几种药物的配伍使用及奶牛源大肠杆菌病的中草药防治提供参考，但中草药药物成分复杂多样，不同的药物对菌株的抑制机理还需要进一步探究，其中中草药提取方法及提取条件仍需进一步优化。

4 结 论

本研究成功分离出致病性奶牛源大肠杆菌菌株，水提取法中单味中草药五倍子、五味子抑菌效果最明显；醇提取法中五倍子抑菌效果最明显；乌梅和五味子联合用药抑菌效果最明显。