干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

谭皓云，刘 茜，胡德宝，张林林，李 新，丁向彬，郭 宏，郭益文

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384)

肌肉系统是维持动物体生长发育的重要基础。大量研究发现，许多长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)与肌肉生长发育相关，如lncMAR1[1]、lncMALAT1[2]、lncMAAT[3]等。lncRNA曾因为只有极少数序列编码蛋白质、绝大部分编码非蛋白质而一度被认为是基因组序列中累积的“垃圾产物”[4]。直到美国启动ENCODE研究计划后人们才发现在基因组序列中较大部分为长度>200 nt的lncRNAs[5]。研究表明，lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用，是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子[6]。目前对于lncRNA的研究主要集中在对生物体的调控作用或编码小肽等方面[7-8]。此外，lncRNA还与肌肉发育相关，如在小鼠体内过表达lncRNA MAR1可增加小鼠肌肉重量和强度，敲低后肌肉重量和强度降低[1]；干扰linc-RAM可抑制小鼠骨骼肌卫星细胞分化过程，影响肌肉再生[9]；干扰lnc-mg可导致小鼠肌肉萎缩，过表达lnc-mg会造成小鼠肌肉肥大[10]。由于lncRNA作用机制复杂，方式多样，在物种间保守性很低，使得不同种属动物lncRNA之间作用关系不大，且目前研究多集中于人和小鼠等生物体内，而对牛肌肉生长影响鲜有报道[11]。实验室前期测序共发现13条差异表达的lncRNAs，其中lnc23对牛骨骼肌卫星细胞具有调控作用[12]。鉴于此，本试验选择其中一条差异高表达的lnc721进行探究，深入分析lnc721干扰模型对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的调控作用，以期为研究lncRNA在牛肌肉中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 原代牛骨骼肌卫星细胞来源于6月龄西门塔尔胎牛的腿臀肌、肩胛肌，均由天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室分离并冻存。

1.1.2 主要试剂及仪器 siRNA和Cell-LightTMEdU ApolloinvitroKit均购自广州瑞博生物技术有限公司；Opti-MEM®Meduium、胎牛血清和马血清均购自Life Technologies公司；DMEM培养基购自HyClone公司；ECL试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶、RIPA Buffer和PMSF均购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；All-in-OneTMqPCR Mix购自GeneCopoeia公司；MyHC抗体购自DSHB公司；MyoG抗体、GAPDH抗体和Goat Anti-mouse IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

细胞恒温培养箱购自三洋电机公司；倒置显微镜购自Leica公司；Light Cycler®96荧光定量PCR仪购自上海罗氏制药有限公司；PowerPac Basic电泳仪、Mini-Protean Tetra、MiniTyans-Blot Cell及电泳凝胶成像系统ChemiDocXRS+均购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 原代牛骨骼肌卫星细胞复苏后采用含10% FBS的DMEM培养基进行培养，待细胞汇合度达80%左右时进行传代，将细胞传至合适大小的孔板中，加入含10% FBS的DMEM增殖培养基继续培养，当细胞全部贴壁后进行转染处理，转染时的细胞密度为50%～60%。收取增殖期细胞继续培养24 h，分化期细胞需使用含2% HS培养基培养[12]。对增殖期及分化期第1、2、3天的牛骨骼肌卫星细胞提取RNA，利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit进行cDNA模板制备，反应条件为：42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min。―20 ℃保存备用。

1.2.2 lnc721生物信息学分析与亚细胞定位 根据牛全基因组序列比对，在NCBI中查询lnc721序列信息及上、下游基因，初步搜索潜在的靶基因；使用CPC网站预测lnc721编码能力。牛骨骼肌卫星细胞诱导分化48 h后，采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit进行核质分离试验，确定亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR对lnc721进行亚细胞定位分析[13]，以GAPDH和Pre-GAPDH分别作为细胞质(cyt)和细胞核(nuc)的标志基因，引物序列见表1。PCR反应体系20 μL：2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。结果采用2―ΔΔCt方法计算。

1.2.3 牛骨骼肌卫星细胞转染 3个lnc721 siRNAs干扰序列均由广州瑞博生物技术有限公司设计并合成：ASO-bta-lnc721_001(si-1)：5′-TTTCAAGCAGCCAGACAAAG-3′；ASO-bta-lnc721_002(si-2)：5′-AGGATGTCGCT-GTCTGTATA-3′；ASO-bta-lnc721_003(si-3)：5′-GGATCACAG-CCTGCCAACAC-3′。将牛骨骼肌卫星细胞培养至可转染状态，分别将合成的3个干扰序列及对照(NC)转染进肌卫星细胞中，每组3个生物学重复。提取增殖期细胞RNA，反转录为cDNA后进行实时荧光定量PCR试验。以GAPDH为内参基因检测干扰效果，选用效果最佳的siRNA进行下一步试验。引物序列见表1，PCR反应体系及程序同1.2.2。

1.2.4 EdU检测 将细胞接种至96孔板中，设置试验组和对照组，各3个生物学重复，试验操作按照Cell-LightTMEdU ApolloinvitroKit说明书进行。通过荧光显微镜观察染色结果，每孔拍照并计数，推算出EdU标记指数。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测牛骨骼肌卫星细胞标志因子mRNA表达量 将牛骨骼肌卫星细胞传代至24孔板中，待细胞贴壁后进行siRNA转染，转染后6 h换液处理，24 h后收取增殖期RNA，分化期细胞需更换成分化培养基，并定期观察细胞分化状态。于分化第3天收取细胞提取RNA，反转录为cDNA后，采用实时荧光定量PCR检测细胞增殖标志因子(Ki-67和Pax7)及分化标志因子(MyHC和MyoG)的mRNA表达水平，引物序列见表1，PCR反应体系及程序同1.2.2。

1.2.6 Western blotting检测牛骨骼肌卫星细胞标志因子蛋白水平表达量 采用RIPA蛋白裂解液提取细胞蛋白，采用BCA方法确定蛋白质浓度，使用酶标仪检测蛋白质量。SDS-PAGE参数：80 V 30 min，120 V 45 min；转膜条件：300 mA 2 h。采用Western blotting检测Pax7、Ki-67、MyHC、MyoG及内参蛋白水平表达量，先将待测条带装入含有一抗的杂交袋中，4 ℃过夜孵育，取出后清洗5次，每次5 min，随后孵育对应二抗1 h，再次清洗5次，每次5 min，使用ECL发光液上机曝光[14-16]。

1.2.7 统计分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实时荧光定量PCR及Western blotting结果采用t检验进行分析，EdU染色结果采用卡方检验进行分析，数据以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 lnc721在牛骨骼肌卫星细胞分化前后的表达量

收集增殖期、分化期第1、2、3天的牛骨骼肌卫星细胞并提取RNA，通过实时荧光定量PCR分别检测lnc721的时间序列表达量情况，结果见图1。由图1可知，随着时间的推进，lnc721的表达量逐渐升高，在分化期第2天，lnc721在牛骨骼肌卫星细胞中的表达量开始极显著升高(P<0.01)；在分化期第3天，表达量相较增殖期升高约4倍(P<0.01)。

①GM,牛骨骼肌卫星细胞增殖期；DM1、DM2、DM3,牛骨骼肌卫星细胞分化1、2、3 d。②与GM期相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；ns，差异不显著(P>0.05)

2.2 lnc721生物信息学分析及亚细胞定位

通过NCBI比对发现，lnc721位于18号染色体上，为未报道的lncRNA。CPC网站预测发现，lnc721编码潜能为―1.33129(图2)。核质分离试验表明，lnc721在细胞核和细胞质内均有分布，主要位于细胞质内(图3)。

图2 CPC网站lnc721蛋白编码能力预测

图3 lnc721亚细胞定位检测

2.3 干扰lnc721表达对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

将lnc721的siRNAs(si-1、si-2、si-3)转染进牛骨骼肌卫星细胞中，收取增殖期细胞，通过实时荧光定量PCR检测干扰lnc721在增殖期的表达量，结果见图4。由图4可知，与对照组相比，si-1、si-2、si-3均极显著降低了lnc721的表达(P<0.01)，其中si-1效果最明显。

与对照组(NC)相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；ns,差异不显著(P>0.05)。下同

将lnc721的si-1转染进牛骨骼肌卫星细胞中，分别提取增殖期和分化期RNA进行实时荧光定量定量PCR检测，结果见图5。由图5可知，si-1在细胞增殖期和分化期均极显著或显著下调了lnc721表达量(P<0.01；P<0.05)。进一步采用EdU染色试验检测增殖期细胞数量变化，结果见图6。由图6可知，与对照组相比，试验组细胞数量明显增多，统计发现，EdU阳性细胞率显著高于对照组(P<0.05)。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测干扰lnc721对增殖标志因子Ki-67和Pax7基因在mRNA及蛋白水平表达的影响，结果见图7、8。由图7、8可知，干扰lnc721后，Ki-67和Pax7基因mRNA表达量均极显著上调(P<0.01)；Ki-67蛋白表达量变化不显著(P>0.05)，Pax7蛋白表达量极显著升高(P<0.01)。表明干扰lnc721可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖。

图5 siRNA对lnc721表达量的影响

A,EdU染色图；B,EdU阳性细胞率统计图

图7 细胞增殖标志因子mRNA表达水平

A，Western blotting曝光图；B，Western blotting量化结果。图10同

2.4 干扰lnc721表达对牛骨骼肌卫星细胞分化影响

将骨骼肌卫星细胞进行成肌诱导分化，检测干扰lnc721后对分化标志因子MyHC和MyoG在mRNA及蛋白水平表达的影响，实时荧光定量PCR结果发现，与对照组相比，干扰lnc721后MyHC和MyoG基因表达量均极显著降低(P<0.01，图9)；MyoG蛋白表达量变化不显著(P>0.05)，但MyHC蛋白表达量极显著降低(P<0.01，图10)。提示干扰lnc721可以显著抑制肌卫星细胞的成肌分化进程。

图9 细胞分化标志因子mRNA表达水平

图10 Western blotting检测细胞分化标志因子蛋白表达水平

3 讨 论

研究发现，许多lncRNAs参与调控肌肉的生长发育，是影响骨骼肌功能的关键因子，而这些lncRNAs常常在骨骼肌细胞分化期内展示出时序上升表达趋势，如linc-MD1[17]、lncMyoD[18]、lncRNA-133a[19]等。本研究通过时序表达谱发现，在骨骼肌细胞分化第3天，lnc721表达量与增殖期相比高达4倍以上，故选取分化期第3天的细胞进行后续干扰试验，且经检测发现分化期第3天的lnc721干扰模型对牛骨骼肌卫星细胞分化具有显著的抑制作用。

亚细胞定位是决定lncRNA功能的关键，定位于细胞质和细胞核中lncRNA发挥的功能大不相同。相较于细胞核定位的lncRNA,位于细胞质中的lncRNA可影响mRNA的稳定性[20-21]。另外，细胞质定位的lncRNA通常吸附miRNA形成ceRNA以调节它们的活性和水平，影响蛋白质翻译后修饰等功能[22-24]。本研究发现，lnc721在细胞核与细胞质中均有分布，但主要定位于细胞质中。Zhai等[25]研究发现，大部分的linc-RAM存在于肌肉细胞的细胞质中，可通过调节PYGM活性促进肌肉细胞分化；Tan等[26]研究报道，定位于细胞质的lncRNAG1430可作为ceRNA海绵吸附ssc_miR-133a-3p，从而促进猪的成肌细胞分化并抑制细胞增殖。本研究中的lnc721与以上研究的lncRNA亚细胞定位相同，推测lnc721可能发挥了某种细胞质lncRNA功能，参与了对牛骨骼肌卫星细胞增殖的正调控及对其分化的负调控。

研究表明，设计过表达及干扰模型可检测lncRNA在细胞增殖期和分化期的表达量水平[27]，而通过不同时期标志因子的表达量检测可以间接反映出目的基因对牛骨骼肌卫星细胞的调控情况。如Ki-67、Pax7基因在细胞增殖期大量表达，可将其作为细胞增殖期标志因子[28-29]。本研究中，干扰lnc721后发现，Ki-67、Pax7基因的表达量在转录组水平上均显著上调，这与Chen等[12]发现的在干扰lnc23后可正调控牛骨骼肌卫星细胞增殖的作用相一致；而在细胞周期退出、分化开始时期，MRFs家族基因发挥着重要的调控作用，其中MyoG基因参与调控肌细胞融合；MyHC基因作为骨骼肌内粗肌丝的主要成分，在细胞分化后期大量表达[30-31]。本研究在干扰lnc721后，MyHC和MyoG基因表达量在转录组水平上均极显著降低；在蛋白水平上MyHC表达量极显著下调，即在牛骨骼肌卫星细胞分化期呈现出的负调控作用，与Chen等[12]研究的干扰lnc23可抑制牛骨骼肌卫星细胞分化的调控作用相一致，但与张俊星等[32]研究的干扰lncRNA135494可正调控牛骨骼肌卫星细胞分化作用相反，推测其原因是由于不同基因具有不同的调控表达所致。此外，在对增殖标志因子Ki-67和分化标志因子MyoG的蛋白水平检测时均出现了表达量变化不显著的情况，其原因可能与这些标志因子自身表达特性的影响相关，在基因翻译阶段受其他因素影响所致，但根据Pax7及MyHC蛋白水平的表达量结果可以看出，干扰lnc721具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖并抑制其分化的作用。

4 结 论

本研究通过转染siRNA对牛骨骼肌卫星细胞中lnc721进行干扰发现，干扰lnc721表达可以促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制其成肌分化过程，验证了干扰lnc721表达在调控肌肉发育分化中的生物功能。