牛病毒性腹泻病毒对新西兰白兔致病性分析及E2蛋白免疫效果的评价

赵逢淼，郭 婷，周雅坪，赵红梅，王宇琛，田广原，孙雅婕，卞宇晨，于佳梁，郝永清

(内蒙古农业大学，兽医微生物学与免疫学实验室，呼和浩特 010018)

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的疾病。主要临床症状表现为流涎、呼吸急促、精神不振、食欲大减或废绝，口腔颊部有散在溃疡面，水样或稀便腹泻，粪便恶臭或有血液[1]。BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，同属的还有典型猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和边界病病毒(Border disease virus, BDV)[2]。BVDV基因组全长12.5～12.8 kb，包括5′-非编码区(untranslated region, 5′-UTR)、3′-非编码区(3′-UTR)和一个开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白[3]。根据5′-UTR序列可将病毒分为BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3 3个基因型[4]，此外，根据该病毒的致细胞病变能力还可分为致细胞病变型(CP型)和非致细胞病变型(NCP型)2个生物型。自1980年中国首次在吉林省发现本病并分离出病毒以来，牛病毒性腹泻病已在中国呈普遍流行趋势[1]。

BVDV主要感染偶蹄类哺乳动物，包括肉牛、奶牛、水牛、骆驼和鹿等[5]，这些动物价格高，不适宜作为试验动物，因此选择合适的替代动物对于研究BVDV致病机理、疫苗研制、疫苗保护性验证以及药物筛选等研究具有重要意义。目前用于BVDV研究的替代动物试验中，Seong等[6-7]通过腹腔注射和滴鼻的方式接种3株BVDV及口服CP型BVDV感染BALB/c小鼠，结果显示，通过腹腔注射和滴鼻方式感染的小鼠，虽在临床上未出现明显的病症，但血液RT-PCR和免疫组化结果证明小鼠感染了BVDV，口服接种CP型BVDV小鼠则显示与BVDV感染一致的病症。Bachofen等[8]通过静脉注射、滴鼻及采食BVDV污染干草的方式感染兔，兔淋巴器官表现出典型病毒感染的组织学变化。Grant等[9]对胎盘、母兔及后代采用BVDV特异性RT-PCR及ELISA方法检测，结果证明BVDV可经胎盘感染兔。目前关于BVDV感染兔的致病性和动物感染模型的研究较少，兔作为BVDV感染宿主的作用尚未明晰。本研究利用滴鼻和耳缘静脉注射BVDV的方式感染新西兰白兔，用E2重组蛋白与佐剂混合后经肌内多点注射免疫，通过血液学、组织病理学和免疫组化等方法评估疾病进展及免疫效果，分析BVDV对感染新西兰白兔的致病性并验证E2重组蛋白的免疫效果，以期为BVDV致病机理和新型疫苗的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

20只健康的体重为1.5～2 kg的3月龄雌性新西兰白兔购自北京兴隆实验动物养殖场；BVDV-1 MCD分离株、BVDV E2蛋白(大肠杆菌表达系统)均由内蒙古农业大学兽医学院微生物学与免疫学实验室分离/克隆表达并保存；牛肾上皮细胞(MDBK)、DMEM细胞培养液均购自Gibco公司；总RNA极速抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗牛IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、BCA法蛋白浓度测定试剂盒、ELISA酶标板均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BVDV牛标准阴、阳性血清购自中国兽药监察所；TMB显色液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 BVDV的纯化及病毒滴度的测定

将浓度为10%、20%、30%、40%、50%的蔗糖溶液由高浓度至低浓度缓慢加入到超速离心管中，再将BVDV-1 MCD病毒液缓慢加在液面的最上层，30 000×g离心12 h，离心后可见1条清晰的乳白色病毒条带，将上层蔗糖溶液吸弃，沿离心管壁吸出乳白色病毒液即为纯化的病毒。将病毒液用DMEM培养基10倍梯度稀释(10-1至10-8)，接种于96孔培养板中MDBK,其中每个稀释度接种8孔，每孔100 μL，同时设细胞对照组，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察并记录细胞病变情况，按照Reed-Muench法计算BVDV的病毒滴度。

1.3 BVDV对新西兰白兔致病性分析

1.3.1 新西兰白兔感染BVDV及样品采集 将10只新西兰白兔随机分为感染组和对照组，每组5只。在常规条件下饲养7 d后，取适量乙醚将新西兰白兔麻醉，感染组每只接种纯化病毒液1 mL[8](此时记为1 d)，其中滴鼻500 μL、耳缘静脉注射500 μL；对照组分别用500 μL生理盐水滴鼻和注射，连续3 d，每天1次，每天上午观察新西兰白兔临床症状并测量体温。在感染后第6、9、12、15、17天通过耳缘静脉采集新西兰白兔血液于加抗凝剂(EDTA)的采血管中。第17天剖杀所有兔，在剖杀前采集鼻拭子，剖杀后分别采集气管、肺脏、小肠、脾脏并用10%福尔马林固定。

1.3.2 RT-PCR鉴定BVDV感染情况 BVDV PCR引物参考王媛媛等[10]研究，引物序列：上游引物：5′-GRAGTCGTCARTGGTTCGAC-3′；下游引物：5′-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将新西兰白兔鼻拭子用DMEM培养液冲洗、震荡后，12 000×g离心10 min，提取上清液RNA并反转录合成cDNA进行PCR鉴定，阳性对照为BVDV在MDBK中培养提取的RNA，阴性对照为ddH2O。PCR反应体系25 μL：GreenTaqMix 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板3 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.3 血常规测定 分离采集的感染后第6、9、12、15、17天的新西兰白兔血清，使用全自动血细胞分析仪(BC-2600 Vet，迈瑞医疗器械有限公司)进行血常规检测，包括白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)、血小板(PLT)。

1.3.4 组织病理学检测 将10%福尔马林中固定24 h以上的气管、肺脏、脾脏、小肠组织取出，用50%、70%、80%、95%、无水乙醇(2次)将固定的各组织进行脱水处理，脱水后使用二甲苯进行组织透明，然后浸蜡包埋，将包埋好的组织进行切片、贴片、脱蜡等操作，进行HE染色，染色后的切片经无水乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明，封固后镜检观察新西兰白兔各组织的病变情况。

1.4 BVDV E2蛋白免疫原性效果评价

1.4.1 新西兰白兔免疫攻毒及样品采集 将10只新西兰白兔随机分为免疫组和对照组，每组5只。在常规条件下饲养7 d后，耳缘静脉采血，制备免疫前兔血清。用E2重组蛋白进行免疫，一免使用弗氏完全佐剂，将纯化E2重组蛋白(2 mg/mL)与弗氏完全佐剂1∶1混匀，用漩涡混合器震荡30 min进行乳化，免疫组兔肌内注射1 mL，对照组注射等体积生理盐水；一免后14 d进行二免；二免用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及操作过程同一免，对照组同样注射等体积生理盐水。分别于一免后第7、14、21、28天经耳缘静脉采血，分离血清。一免后28 d攻毒。攻毒程序同1.3.1。感染17 d后剖杀所有兔，在剖杀之前采集气管鼻拭子，剖杀后分别采集气管、肺脏、小肠、脾脏用10%福尔马林固定。

1.4.2 抗体间接ELISA检测 用间接ELISA法检测一免前及一免后第7、14、21、28天血清的抗体水平。具体步骤如下：取96孔ELISA板，每孔加入100 μL 2 μg/mL E2蛋白4 ℃包被过夜；PBST洗3次，每次5 min，加10% PEG4000于37 ℃封闭2 h；PBST洗3次，每次5 min；将血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096稀释后，BVDV标准阴性、阳性血清按1∶100稀释后，分别加入包被好的ELISA板孔内，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；山羊抗兔IgG-HRP (1∶4 000)二抗37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；用20% TMB显色10 min，用2 mol/L H2SO4终止反应。测定D450 nm值。

1.4.3 RT-PCR鉴定BVDV感染情况 将新西兰白兔鼻拭子用DMEM培养液冲洗、震荡后，12 000×g离心10 min，吸取上清液进行PCR鉴定，鉴定程序同1.3.2。

1.4.4 组织病理学检测 将10%福尔马林中固定24 h以上的气管、肺脏、脾脏、小肠组织取出，制备各组织病理切片并观察病变情况，操作步骤同1.3.4。

1.4.5 免疫组织化学检测 用75%、85%、90%、95%、无水乙醇(2次)将气管、肺脏、脾脏、小肠等组织进行脱水，无水乙醇与二甲苯1∶1混合液透明处理，石蜡浸蜡与包埋，将包埋好的组织进行切片、烤片、切片脱蜡，将脱蜡后的组织切片置于修复液(0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，pH 6.0)(0.01 mol/L EDTA缓冲液，pH 9.0)中修复10～15 min，进行抗原修复，用3%过氧化氢室温孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶，5%山羊血清封闭，一抗BVDV标准阳性血清(1∶100)4 ℃过夜孵育，PBS洗3次，兔抗牛IgG(1∶50)二抗孵育1 h，DAB显色液显色，苏木精复染后封片，在显微镜下观察并拍照。

1.5 数据统计分析

采用GraphPad Prism 6.0软件进行独立样本t检验分析并作图，结果表示为平均值±标准差。P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 BVDV新西兰白兔感染试验结果

2.1.1 BVDV的病毒滴度测定结果 根据Reed-Muench法计算得到BVDV的病毒滴度为4.16×106TCID50/mL。

2.1.2 临床症状及体温的测定结果 BVDV感染组部分新西兰白兔6 d内活动减少，采食略微减少，6 d后逐渐恢复正常，在接种第13天出现腹泻症状。接种病毒后第5天新西兰白兔体温开始略微升高，但均在正常范围内波动，对照组新西兰白兔体温正常(图1)。

图1 各组新西兰白兔体温变化

2.1.3 BVDV的RT-PCR鉴定结果 由图2可知，5只感染组新西兰白兔鼻拭子均扩增出大小为199 bp的条带，5只对照组新西兰白兔鼻拭子均未检测到该目的条带。

M，DL2000 DNA Marker；1～5，感染组鼻拭子培养物；6～10，对照组鼻拭子培养物；11，阳性对照；12，阴性对照

2.1.4 血常规测定结果 由图3可知，与对照组相比，感染组白细胞在攻毒第6和9天显著降低(P<0.05)，在攻毒第12、15和17天极显著降低(P<0.01)；感染组血小板数量在所有检测时间均极显著降低(P<0.01)；感染组淋巴细胞数量在攻毒第12、15和17天均极显著降低(P<0.01)。

2.1.5 组织病理结果 感染组气管上皮细胞有明显水泡样变性，并有散在坏死，出现核浓缩(图4A)；对照组气管黏膜层完整，结构清晰，上皮完整，未见病变(图4B)；感染组肺脏肺间质可见淋巴细胞增生和浸润，特别是血管细支气管周围淋巴细胞呈小灶状，呈弥散性浸润，多数肺组织间质增宽，呈典型轻到中度间质性肺炎，有Ⅱ型上皮细胞增生，炎灶边缘可见代偿性肺气肿(图4C)；对照组支气管、肺泡无明显炎症反应，结构清晰(图4D)；感染组脾脏白髓体积增大，有淋巴细胞增生，生发中心有散在的淋巴细胞核浓缩及破裂，红髓淋巴细胞数量增多(图4E)；对照组白髓和红髓结构清晰完整，未见病变(图4F)；感染组小肠黏膜上皮细胞有脱落，但无坏死，较为完整，固有层可见明显淋巴细胞浸润(图4G)；对照组肠壁结构完整，层次清晰，绒毛上皮细胞完整，无明显病变(图4H)。

①A，感染组气管(200×)；B，对照组气管(200×)；C，感染组肺脏(200×)；D，对照组肺脏(100×)；E，感染组脾脏(200×)；F，对照组脾脏(100×)；G，感染组小肠(200×)；H，对照组小肠(100×)。②箭头代表病变

2.2 新西兰白兔免疫效果评价试验结果

2.2.1 新西兰白兔抗体间接ELISA检测结果 间接ELISA检测表明，在7 d时，免疫组新西兰白兔血清抗体滴度为1∶16～1∶32；在一免后28 d时抗体滴度明显升高，达到1∶256～1∶512(图5)。

图5 新西兰白兔特异性抗体检测结果

2.2.2 BVDV的RT-PCR鉴定结果 5只对照组新西兰白兔鼻拭子均扩增出大小为199 bp的条带，5只免疫组新西兰白兔鼻拭子均未检测到该目的条带(图6)。

M，DL2000 DNA Marker; 1～5，对照组鼻拭子培养物; 6～10，免疫组鼻拭子培养物; 11，阳性对照; 12，阴性对照

2.2.3 组织病理学结果 免疫组气管上皮完整，纤毛明显，黏膜上皮胞浆内有可见小空泡(图7A)；对照组气管上皮细胞有水泡样变性，且有散在坏死(图7B)；免疫组肺脏局部肺泡间隔轻度增宽，大细支气管周围可见淋巴细胞增生结节(图7C)；对照组肺脏呈典型中度间质性肺炎，肺泡细胞周围有大量炎性细胞增生，有Ⅱ型上皮细胞增生，炎灶边缘可见代偿性肺气肿(图7D)；免疫组脾脏红髓白髓界限明显，未见病变(图7E)；对照组脾脏白髓体积增大，红髓淋巴细胞数量增多(图7F)；免疫组小肠粘膜上皮细胞有脱落，但无坏死，较为完整，未见病变(图7G)；对照组小肠上皮有些许脱落，但无坏死(图7H)。

①A，免疫组气管(200×)；B，对照组气管(200×)；C，免疫组肺脏(100×)；D，对照组肺脏(200×)；E，免疫组脾脏(100×)；F，对照组脾脏(100×);G，免疫组小肠(100×)；H，对照组小肠(40×)②箭头代表病变

2.2.4 免疫组化结果 对照组气管、肺脏、脾脏、小肠中均能检测到阳性信号，免疫反应产物为黄色，间质清晰，无背景着色(图8B、8D、8F、8H)；免疫组气管、肺脏、脾脏、小肠免疫组化结果均为阴性(图8A、8C、8E、8F)。

①A，免疫组气管；B，对照组气管；C，免疫组肺脏；D，对照组肺脏；E，免疫组脾脏；F，对照组脾脏；G，免疫组小肠；H，对照组小肠。②箭头为阳性信号

3 讨 论

目前中国BVDV的防控形势十分严峻，牛重点养殖区域均存在BVDV感染，并有愈演愈烈的趋势[11]。牛是BVDV典型的宿主，但并不局限于这种宿主，人们普遍认为BVDV不易感非偶蹄类动物，但一系列试验证明兔能感染BVDV[8-9]，而且兔作为BVDV试验动物的作用仍存疑虑，因此进一步了解兔感染BVDV是十分必要的。

卜凡亮等[12]对家兔采用腹腔注射方法进行BVDV感染，RT-PCR检测感染组血清、淋巴结、脾脏等均为阳性，表明人工感染家兔成功，但BVDV河南分离株感染家兔后除了体温变化外并无特征性临床症状和明显病变；邢思毅等[13]对泌乳兔采用滴鼻攻毒、口腔灌胃攻毒和静脉注射等方法感染BVDV，感染7 d内在肠道黏膜均可检测到BVDV，说明BVDV感染泌乳兔产生致病性作用。以上试验的结果不同可能是由于感染途径、病毒剂量以及试验兔品种差异引起的。在2014年，Bachofen等[8]证实新西兰白兔可通过静脉注射感染BVDV，采食被BVDV污染的干草也可感染，在其大多数器官均检测到了BVDV，且淋巴组织出现了典型病变。因此，为了进一步确定兔作为BVDV宿主的适用性，了解兔作为BVDV感染宿主的作用，本研究将纯化的BVDV病毒液以滴鼻500 μL和耳缘静脉注射500 μL的方式人工感染新西兰白兔，尽管受感染的新西兰白兔只表现出轻微的临床症状，但RT-PCR结果显示，感染组5只新西兰白兔鼻拭子样品为阳性，血液学检测结果表明感染组白细胞、血小板和淋巴细胞数量降低，组织病理学观察显示感染组气管、肺脏、脾脏及小肠表现出轻度至重度的组织病理学变化，均表明BVDV成功感染新西兰白兔。BVDV急性感染能够引起白细胞、淋巴细胞、血小板减少的能力已经在一些研究中报道[7,14-15]，与本研究结果相似。综上所述，滴鼻加耳缘静脉注射CP型BVDV可导致新西兰白兔与上述研究中BVDV感染一致的变化，如病毒抗原的出现，血液学和组织病理学的变化。说明新西兰白兔感染BVDV可能导致血小板产生减少或加速破坏。

E2蛋白在免疫应答过程中起着极其重要作用，是BVDV引起免疫反应活性的重要保护性抗原，是基因工程疫苗的首选保护性抗原。吴桐忠等[16]重组乳酸菌表达的E2蛋白以及王遵宝等[17]利用昆虫细胞-杆状病毒系统表达的E2蛋白均能起到较好的免疫作用。本研究对E2重组蛋白(大肠杆菌表达系统)免疫原性进行验证，结果表明，免疫组新西兰白兔鼻拭子经RT-PCR检测为阴性,初步验证了E2亚单位疫苗能对BVDV起到免疫防御作用；通过对免疫攻毒组与对照组组织病理切片观察对比，E2基因工程亚单位疫苗免疫后能够有效保护新西兰白兔气管、肺脏、脾脏和小肠等器官免受BVDV的损伤；通过间接ELISA方法进行血清学抗体滴度的检测，在免疫期第7天即可检测到抗体水平的增加，在第28天达到较高水平，表明BVDV E2亚单位疫苗可以成功引起新西兰白兔机体的免疫应答反应；在免疫效果评价试验中，免疫组化结果显示免疫组各组织切片均未检测到阳性信号，而对照组新西兰白兔出现了明显的阳性信号。表明BVDV E2亚单位疫苗能够起到很好的免疫保护作用。

4 结 论

本试验结果表明，BVDV可以成功感染新西兰白兔，感染兔出现体温略微升高，活动减少，轻微腹泻等临床症状，气管、肺脏、脾脏和小肠等组织出现轻度至重度的病理学变化，白细胞、淋巴细胞、血小板含量均显著或极显著降低；E2重组蛋白免疫兔后能产生BVDV特异性中和抗体并减轻组织损伤，说明E2重组蛋白可在兔上产生有效的保护作用。