猪DNA甲基转移酶基因家族进化分析

龚文滔，潘向春，蔡佳丽，王祎菲，李加琪，张 哲，袁晓龙

(1.华南农业大学动物科学学院，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，国家生猪种业工程技术研究中心，广州 510642；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525000)

表观遗传学是指基因活性或功能的可遗传变化现象，与DNA序列本身的变化无关。作为研究最广泛的表观遗传机制之一，DNA甲基化是一种不改变DNA序列顺序的碱基修饰[1]，且广泛参与哺乳动物多种生物学进程，包括转录活性调节[2-3]、X染色体失活[2]、基因组印迹[2,4]和染色体稳定性[4]。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG位点的胞嘧啶上，并在细胞分裂过程中被稳定遗传[5]，而DNA甲基化的发生离不开甲基转移酶(DNMT)的催化作用。DNMT可将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸转移到胞嘧啶的第5个碳原子上，从而形成甲基化胞嘧啶[6]。目前哺乳动物中主要发现4种类型的DNMT，分别为DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L[7]。DNMT1主要用于维持基因组的DNA甲基化状态；DNMT3A和DNMT3B具有从头甲基化的功能，即对非甲基化的DNA进行甲基化修饰；DNMT3L可增强DNMT3A和DNMT3B的催化活性，促进DNA的从头甲基化过程[8-9]。

DNMT参与哺乳动物的生长发育和疾病等多种生物学活动。有研究表明，敲除DNMT1或DNMT3B后，小鼠在妊娠期中死亡，而敲除DNMT3A后，小鼠在出生后4周龄死亡[10]。Liao等[11]使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除人类胚胎干细胞中的DNA甲基化转移酶，结果发现DNMT1的缺失导致人类胚胎干细胞的快速死亡。此外，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在转录和翻译水平上的过表达会降低抑癌基因的表达水平，从而导致恶性肿瘤的发生，如结肠癌、肺癌、胶质母细胞瘤、血液系统恶性肿瘤、前列腺癌和乳腺癌[12]。Rhee等[13]表明，同时抑制DNMT1和DNMT3B的表达可使结直肠癌模型中的抑癌基因整体低甲基化并被重新激活，进而导致肿瘤细胞增殖减少。以上结果表明，DNMT广泛参与哺乳动物生物学活动的调控过程。

目前，关于猪DNMT基因家族的系统研究鲜见报道。本研究以猪为研究对象，利用生物信息学方法鉴定猪全基因组范围的DNMT基因家族，并对猪DNMT基因家族成员进行染色体定位、理化性质、二级结构预测、亚细胞定位、基因结构、保守基序、系统进化和种间共线性分析，探讨DNMT基因家族在母猪性腺轴初情启动过程前、中、后的基因表达水平，旨在为进一步探究猪DNMT基因家族功能与调节机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 猪DNMT基因家族的鉴定和染色体定位分析

从Ensembl数据库(https:∥asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)中下载猪的全基因组序列文件、基因注释文件、蛋白质序列文件。从Pfam网站(https:∥pfam.xfam.org/)下载DNMT家族的隐马尔科夫模型(HMM)文件(PF00145)，利用Hammer软件中的hmmsearch程序搜索猪蛋白质序列文件，进而鉴定DNMT基因家族成员。基于Hammer软件的鉴定结果，利用BLASTP程序进行第2次DNMT基因家族鉴定。将Hammer软件和BLASTP程序的鉴定结果合并，得到候选DNMT基因家族成员。通过CDD网站(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwr psb/bwrpsb.cgi)进行保守结构域分析，剔除候选DNMT基因家族成员中不含DNMT特征结构域的序列，最终得到猪DNMT家族成员。从基因注释文件中获得猪DNMT基因的位置信息，并通过TBtools[14]绘制猪DNMT基因的染色体定位图。

1.2 基因结构和保守基序分析

基于基因注释文件，使用TBtools展示DNMT基因家族成员的UTR及内含子信息。通过MEME网站(https:∥meme-suite.org/meme/tools/meme)对DNMT基因家族成员进行保守基序(motif)分析，其中motif数量设置为10个，其余参数选择默认，最后通过TBtools得到可视化图形。

1.3 系统进化树和种间共线性分析

从Ensembl数据库中下载人、小鼠和牛的全基因组序列文件、基因注释文件、蛋白质序列文件，然后使用Hammer软件和BLASTP软件初步鉴定人、小鼠和牛的DNMT基因家族成员，再通过CDD网站进行保守结构域分析，以获得人、小鼠和牛的DNMT基因家族成员。使用Mega 10.1.7软件对猪、人、小鼠和牛的DNMT蛋白质序列进行多重比对，并基于距离参数的邻接法构建系统进化树，设自展值为1 000，其他参数则按默认设置。基于猪、人、小鼠和牛的基因序列文件和基因注释文件，使用TBtools的One Step MCScanX功能进行物种间的共线性分析，并使用TBtools的Dual Systeny Plot for MCScanX功能进行可视化。

1.4 蛋白理化性质、二级结构预测和亚细胞定位分析

利用ExPASy在线工具(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分析猪DNMT基因家族成员的蛋白质特性，预测蛋白质的分子质量和等电点；利用SOPMA在线工具(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)预测DNMT蛋白的二级结构；利用PSORT在线工具(https:∥wolfpsort.hgc.jp/)进行DNMT蛋白的亚细胞定位分析。

1.5 猪DNMT基因家族成员的表达分析

从NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取母猪下丘脑、垂体、卵巢的RNA-Seq数据(登录号：PRJEB39729)[15]，其中每种组织都包含初情启动前、初情启动、初情启动后的转录组数据，共下载27个转录组数据。对转录组数据进行质控后，利用HISAT2软件[16]将转录组数据比对到参考基因组，随后利用Stringtie软件[17]估计基因的表达量，以基因最长转录本的表达量作为该基因的表达水平，从而获得DNMT基因家族所有成员的表达水平。根据DNMT基因表达量的TPM值，利用R语言绘制出基因表达热图。

2 结 果

2.1 猪DNMT基因家族鉴定和染色体定位分析

利用Hmmer软件和BLASTP软件从猪基因组上共鉴定出5个DNMT基因家族成员，并将其命名为PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5，其长度介于13 726～80 213 bp，其中3个基因位于参考基因组的正链，2个基因位于参考基因组的负链(表1)。由图1可知，PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5基因分别位于2、3、13、14、17号染色体上，每条染色体都只包含1个DNMT基因。

2.2 猪DNMT基因序列结构分析

通过MEME在线工具进行保守基序分析，结果如图2所示，PigDNMT1和PigDNMT2仅包含1个motif，PigDNMT3包含6个motif，而PigDNMT2和PigDNMT5包含10个相同的motif且排列顺序一致。基因结构分析结果显示，大部分DNMT基因含有多个CDS区域，仅PigDNMT4含有2个CDS区域；此外，还发现PigDNMT1、PigDNMT3和PigDNMT5缺少3′-UTR(图2)。从猪DNMT基因家族进化树的角度分析发现，PigDNMT1和PigDNMT4、PigDNMT2和PigDNMT5的亲缘关系较近(图2)。整体而言，同一分支上的DNMT基因在motif数量上相似，但在基因结构上差异较大。

图2 猪DNMT基因家族结构特征

2.3 DNMT基因的系统进化分析

本研究使用Hammer和BLASTP软件在人、小鼠、牛中分别鉴定出6、7、5个DNMT基因(表2)，并结合5个猪DNMT基因构建系统进化树，结果如图3所示，23个DNMT基因可分成Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ 3个亚族，其中Class Ⅰ亚族可被进一步细分为Class Ⅰ-a和Class Ⅰ-b亚族。在4个亚族中，Class Ⅰ-a亚族的DNMT基因数量最多，共有14个DNMT基因，其中包含PigDNMT1、PigDNMT3和PigDNMT4；Class Ⅰ-b共有5个DNMT基因，其中包含PigDNMT5；Class Ⅱ亚族共有3个DNMT基因，其中包含PigDNMT2；而Class Ⅲ亚族的DNMT基因数量最少，仅包含CattleDNMT5。此外，根据猪与人、小鼠、牛的进化关系发现，猪与牛的DNMT基因家族亲缘关系更近。

表2 人、小鼠和牛DNMT基因家族成员基本信息

图3 猪、人、小鼠和牛DNMT基因家族的系统进化树

2.4 DNMT基因的共线性分析

为了进一步了解猪DNMT基因家族的进化关系，使用TBtools的One Step MCScanX功能对猪、人、小鼠和牛中DNMT基因家族进行物种间的共线性分析。如图4所示，猪和人、小鼠、牛之间具有4对直系同源DNMT基因，其中PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4都能在人、小鼠和牛中鉴定到相应的直系同源基因，只有PigDNMT5无法在其他3个物种中检测出直系同源基因。

图4 猪、人、小鼠和牛DNMT基因家族的共线性分析

2.5 猪DNMT蛋白的理化性质、二级结构预测及亚细胞定位

猪DNMT基因家族成员的蛋白长度在228(PigDNMT4)～1 706 个氨基酸(PigDNMT1)之间；分子质量介于26 133.32(PigDNMT4)～192 267.80 u(PigDNMT1)之间；而蛋白等电点最小为6.00(PigDNMT3)，最大为9.06(PigDNMT4)，其中2个DNMT蛋白呈酸性(等电点<7)，3个DNMT蛋白呈碱性(等电点>7)(表3)。二级结构预测结果显示，猪DNMT基因家族蛋白的二级结构主要由无规则卷曲组成，随后依次为α-螺旋、β-转角、延伸链。亚细胞定位分析发现，猪DNMT基因家族蛋白全部定位于细胞核中(表4)。

表3 猪DNMT蛋白的理化性质

表4 猪DNMT蛋白的二级结构预测和亚细胞定位

2.6 不同发育时期猪DNMT基因家族的表达变化

对猪性腺轴初情启动前、初情启动、初情启动后的转录组数据进行分析，结果如图5所示，PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5基因在性腺轴初情启动过程中都处于低表达状态，而PigDNMT1表达量明显高于其他4个基因，且在初情启动过程的不同组织中发生不同的变化。在初情启动过程的下丘脑组织中，PigDNMT1基因表达量先升高后降低；在初情启动过程的垂体组织中，PigDNMT1基因表达量逐渐升高；在初情启动过程的卵巢组织中，PigDNMT1基因表达量逐渐下降。

H，下丘脑；P，垂体；O，卵巢；Pre，初情期启动前；In，初情期启动中；Post，初情期启动后

3 讨 论

在猪生长发育过程中，DNMT可能通过影响DNA甲基化状态和形成过程而参与多种生物学机制，但是在猪中对于DNMT基因家族的系统分析还不全面。本研究利用生物信息学方法在猪基因组上共鉴定出5个DNMT基因，基因数目低于人(6个)和小鼠(7个)，而与牛(5个)一致，这可能与基因组的大小及基因的丢失和保留事件有关[18]。猪DNMT基因家族进化树和保守基序分析发现，PigDNMT2和PigDNMT5的亲缘关系较近，且具有相同数量和排列顺序的motif，说明这2个基因在进化过程中具有较高保守性，推测PigDNMT2和PigDNMT5可能具有相似的基因功能。从基因结构的整体而言，猪DNMT基因家族成员之间的基因结构差异较大，如基因长度(13 726～80 213 bp)和CDS区长度(1 137～5 081 bp)，这与鸡NLRs基因家族和杜兰落花生球蛋白基因家族的基因结构分析结果一致[19-20]。另有研究表明，各成员间基因结构的差异可能与基因进化过程中出现重复、插入和缺失等突变现象有关[21]。基因共线性分析发现，猪和人、小鼠、牛之间都具有4对直系同源DNMT基因，说明4个物种之间具有较强的共线性关系，而从4个物种的系统进化树分析结果中可以看出，猪与牛的DNMT基因家族亲缘关系更近。亚细胞定位分析结果显示，5个猪DNMT蛋白处于细胞核中。彭忠明等[22]也在毛竹中发现7个DNMT蛋白定位于细胞核中，这些结果表明DNMT可能是在细胞核内参与生物学进程。

基因表达模式与其生物学功能高度相关。本研究揭示了母猪性腺轴组织中DNMT基因家族在初情启动前、初情启动、初情启动后中的表达模式，结果表明PigDNMT1表达量在下丘脑、垂体和卵巢组织中随着初情启动过程而发生不同的变化，如垂体组织中的PigDNMT1表达量在初情启动过程中逐渐上升，而卵巢组织中的PigDNMT1表达量在初情启动过程中逐渐下降。性腺轴可通过调节激素分泌驱动雌性动物的初情启动[23-24]，进一步说明PigDNMT1可能在母猪初情启动过程中发挥重要的调控作用，这与前人关于DNMT基因可能通过调控促性腺激素释放激素(GnRH)的表达而参与母羊初情启动的调控相符合[25]。另外有研究表明，DNA甲基化参与哺乳动物初情启动的调控过程[26-27]。Lomniczi等[26]给大鼠注射DNA甲基化抑制剂之后，大鼠下丘脑中的胚胎外胚层发育(Eed)基因和染色盒同源物7(Cbx7)基因的表达水平上升，启动子的甲基化水平下降，并且大鼠的阴道开放延迟，未达到初情期，表明DNA甲基化在大脑的神经内分泌中起作用，通过抑制初情期启动所需的基因(如吻素1(Kiss1)基因)控制青春期。Zhou等[27]研究发现，DNA甲基化可通过调节R-脊椎蛋白2(RSPO2)的表达水平影响卵泡发育进而影响母猪的初情启动。综合以上结果及DNMT在DNA甲基化状态和形成过程中的作用，说明猪DNMT基因家族中的PigDNMT1可能通过影响性腺轴关键基因的DNA甲基化参与母猪初情启动的调控过程，这对于母猪初情启动调控机制研究具有重要的参考价值，但PigDNMT1在母猪初情启动过程中的作用机制需要进一步研究和分析。

4 结 论

本研究利用生物信息学方法在猪基因组上共鉴定出5个DNMT基因，并发现PigDNMT2和PigDNMT5在进化过程中具有较高保守性。共线性和进化树分析结果表明，猪、人、小鼠和牛的DNMT基因间存在较强的共线性关系，但猪与牛的DNMT基因家族亲缘关系更近。此外，性腺轴组织中的PigDNMT1在初情启动过程中呈现出不同的表达模式。本研究可为深入解析猪DNMT基因家族功能提供一些参考。