基于TLR4/NF-κB 信号通路探讨盐酸班布特罗干预COPD 模型大鼠血管重塑的机制研究

郑春晨 佘晖

COPD 是一种常见的可防可治的疾病,主要特征为不完全可逆的气流受限,气流受限主要与肺部对香烟烟雾等有害气体或颗粒引起的慢性炎症,进而引起气道、血管、肺实质等结构和功能异常相关。众多国内外相关研究表明：COPD 的主要病理改变为血管重塑,其进行性加重会导致肺动脉高压,进而发展为肺源性心脏病(肺心病),最后导致死亡。及时有效的干预血管重塑是阻止COPD 病情进展的重要步骤［1,2］。β2-受体激动剂(班布特罗)用于哮喘、COPD 治疗历史悠久,越来越多的研究证明,其除了支气管舒张作用,β2-受体激动剂对气道慢性炎症具有一定的抑制作用［3,4］。本实验探讨盐酸班布特罗改善COPD 模型大鼠症状的一般情况,探讨其与血清VEGF、ET-1、CTGF 含量水平的相关性,进而探讨其是否干预COPD血管重塑。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取浙江省维通利华实验动物技术有限公司提供的SPF 级雄性 SD 大鼠 30 只,8 周龄,质量(200±20) g,环境温度 24～26℃,湿度50%。

1.2实验试剂 脂多糖(批号：L8274,Sigma 公司,026︰B6)；盐酸班布特罗(阿斯利康制药有限公司,国药准字H19990072,规格：10 mg/片)；天下秀香烟(四川中烟工业有限责任公司)；大鼠血清VEGF、大鼠血清ET-1、大鼠CTGF 酶联免疫吸附试剂盒(购买于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；TLR4/NF-κB 免疫组化试剂盒(购买于武汉赛维尔生物有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1制作COPD 模型 将30 只SD 大鼠于动物房适应性饲养7 d 后,随机分为空白对照组、模型组和给药组,每组10 只。模型组、给药组采用目前国内外公认的烟熏联合LPS 法建立 COPD 大鼠模型：造模周期为42 d,将大鼠每天定时在自制烟熏箱内用香烟烟熏,而在第1、14 天时用水合氯醛麻醉,气管内滴注1 mg/ml LPS 溶液0.2 ml。空白对照组大鼠不烟熏,气道内滴注等体积生理盐水代替。COPD 造模成功与否主要观察肺血管的病理变化情况。

1.3.2药物干预 造模成功后,模型组和给药组大鼠继续适当烟熏保持模型,同时给药组大鼠给予盐酸班布特罗灌胃,1 次/d,连续给药45 d；空白对照组和模型组大鼠给予同体积生理盐水灌胃。

1.3.3标本采集 所有大鼠于实验第88 天标本采集(42 天造模,45 天结药)。用水合氯醛充分麻醉,开胸后进行心脏取血,血液室温静置2 h 后,以4℃、3000 r/min 条件离心10 min,取上清液,保存于-20℃冰箱备用。同时分离出双肺,用生理盐水多次漂洗后用4%多聚甲醛进行固定,后续石蜡包埋、切片。

1.3.4ELISA 检测大鼠VEGF、ET-1、CTGF表达按照ELISA 试剂盒说明书操作分别测定各组大鼠VEGF、CTGF、ET-1 表达情况。

1.3.5免疫组化测定TLR4/NF-κB 蛋白表达 将切片脱蜡水化,双氧水封闭,抗原修复后,按照试剂盒说明书滴加TLR4/NF-kB 的一抗、二抗,苏木素复染,脱水,封片。同时使用武汉赛维尔图像分析系统自动分析玻片内弱中强阳性细胞数,根据切片情况对阳性细胞数进行评价。

1.4观察指标 观察三组大鼠COPD 模型建立后肺组织HE 染色情况；比较三组大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表达水平及血清VEGF、ET-1、CTGF 表达水平。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差()表示,多组间比较采用F 检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1三组大鼠COPD 模型建立后肺组织HE 染色情况空白对照组肺组织：肺泡结构完整,无炎症细胞浸润,肺血管壁正常；模型组肺组织：肺泡壁断裂,肺泡壁融合肺大泡形成,肺血管壁明显增厚,大量炎症细胞浸润,符合COPD 大鼠肺组织病理改变；给药组肺组织：肺泡壁部分断裂,肺泡壁部分融合成为肺大泡,肺泡血管壁稍增厚,肺部炎症细胞虽有浸润,但较模型组明显减少。见图1,图2,图3。

图1 空白对照组肺组织HE 染色×200

图2 模型组肺组织HE 染色×200

图3 给药组肺组织HE 染色×200

2.2三组大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表达水平比较模型组和给药组大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表达水平均高于空白对照组,模型组高于给药组,三组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1,图4,图5,图6,图7,图8,图9。

图4 空白对照组NF-κB 表达情况×200

图5 模型组NF-κB 表达情况×200

图6 给药组NF-κB 表达情况×200

图7 空白对照组TLR4 表达情况×200

图8 模型组TLR4 表达情况×200

图9 给药组TLR4 表达情况×200

表1 三组大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表达水平比较()

表1 三组大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表达水平比较()

注：三组比较,P<0.05

2.3三组大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表达水平比较 模型组和给药组大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表达水平均高于空白对照组,模型组高于给药组,三组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表达水平比较()

表2 三组大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表达水平比较()

注：三组比较,P<0.05

3 讨论

目前COPD 的病因仍不十分明确,但已知血管重塑是其非常重要的病理改变,血管重塑与烟雾、职业粉尘、化学物质、感染、慢性缺氧所形成的诸多细胞因子表达异常相关［5,6］。据国内外研究显示,VEGF 与COPD 的肺血管重构密切相关,VEGF 是最强的血管生成激活因子,它可以刺激现有血管内皮细胞的迁移和增殖,产生和稳定新的血管［7］。ET-1 是内皮细胞合成并分泌的收缩血管的多肽,在各种缺氧及炎症反应的刺激下,肺微小动脉出现内皮损伤,导致ET-1 和一氧化氮失衡,引起持续的肺血管收缩,肺循环阻力增高,产生肺动脉高压；同时会提高血管平滑肌的增殖速度,肺血管壁增厚,管腔狭窄或闭塞［8］。CTGF 是一种有效的血管生成因子,促进成纤维细胞增殖及细胞外基质的产生,参与COPD 气道重构和血管重构的发生发展［9］。大鼠的VEGF、ET-1、CTGF 表达上调与肺的慢性炎症相关,是目前评估血管重塑的重要指标。

TLR4/NF-κB 信号通路在COPD 血管重塑病变中发挥重要作用。TLR4 与各种内源性和外源性配体结合,通过MyD88 依赖性途径和MyD88 非依赖性途径激活TLR4/NF-κB 通路,产生各种炎症因子,从而导致血管内皮细胞损伤以及血管平滑肌细胞增生、迁移［10,11］。肾上腺素β2-受体激动剂用于哮喘、COPD 治疗历史悠久,传统上只注意到其对支气管平滑肌的舒张作用,近年来越来越多的研究证明,β2-受体激动剂对气道慢性炎症具有一定的抑制作用,并对其作用机制做了许多研究［12］。Farmer 等［3］研究发现β2-受体激动剂明显抑制κB (NF-κB 抑制分子)降解,从而抑制 NF-κB 活化,而且这一作用可被β2-受体阻断剂所拮抗。张志大等［13］的研究也表明班布特罗能够下调NF-κB 活性及调控因子等炎症因子,从而减轻气道炎症。

本实验以烟熏法联合LPS 制作COPD 模型大鼠。结果显示：模型组和给药组大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表达水平均高于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组和给药组大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表达水平均高于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与文献报道一致［14,15］。这提示可能TLR4 与相应配体结合通过激活NF-κB 信号通路起到促炎作用,导致异常血管增生、肺动脉平滑肌合成异常。与模型组对比,给药组的TLR4、NF-κB、VEGF、ET-1、CTGF 的表达有所降低。推测盐酸班布特罗可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路降低气道慢性炎症,减轻血管重塑,从而使血管平滑肌增生得到改善。

综上所述,盐酸班布特罗可能有效抑制 COPD 血管重塑,其机制可能为班布特罗抑制受体TLR4 表达,降低配体 LPS 和烟雾对TLR4/NF-κB 信号通路的诱导作用,下调血管平滑肌增生相关因子VEGF、ET-1、CTGF 的合成与分泌,从而延缓或阻滞COPD 血管重塑的过程,但具体机制仍不十分明确,仍需做进一步探讨。