苦参碱调控ADMA代谢通路抑制异丙肾上腺素诱导大鼠慢性心力衰竭的作用 *

(1.榆林市第一医院暨延安大学第二附属医院，陕西 榆林 719000；2.榆林市第二医院，陕西 榆林 719000；3．凯里学院化学与材料工程学院，贵州 凯里 556011；4.榆林市中医医院，陕西 榆林 719000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多种病因所致心脏疾病的终末期阶段，是一种以心室重构和神经内分泌激素过度激活为主要特征的临床综合征[1-3]。ADMA是一种内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，与其底物L-精氨酸竞争结合NOS，抑制NO合成，导致内皮功能障碍、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应并促进血液凝固，被认为是一种新型的心血管危险因子[4-5]。血清ADMA水平升高与NYHA功能分级、血清NT-proBNP水平升高呈正相关[6]，是心力衰竭患者具有短期和长期预后价值的综合临床结果的独立预测因子[7]，故MDMA可作为一种新的心力衰竭标志物用于临床CHF的诊断和预后评估。动物实验研究显示，在异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)诱导的大鼠急性心肌缺血和CHF模型中，血清ADMA水平显著增加[8-9]，表明ADMA可促进ISO致大鼠急性心肌缺血和CHF的发生发展。苦参碱是从中药材苦豆子(Sophoraflavescens)中提取的一种具有多种药理活性的生物碱[10]，研究表明其对ISO诱导的心脏肥厚大鼠的心功能和左室重塑的改善作用[11]。本实验旨在通过小剂量ISO诱导大鼠CHF为模型，观察苦参碱对CHF大鼠心肌组织ADMA代谢通路的影响。

1 仪器与材料

1.1仪器 MPA心功能分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)；TY96-Ⅱ N型超生细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Mutiskan Go酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；PowerPac Basic电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Quantity One凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2试药 苦参碱(批号80041122，纯度99.8%宁夏紫荆花药业股份有限公司)；盐酸异丙肾上腺素(美国Sigma公司)；乌拉坦(中国医药上海化学试剂公司)；大鼠cTnI ELISA检测试剂盒、大鼠ADMA ELISA试剂盒(美国R&D公司)；大鼠BNP ELISA检测试剂盒(武汉华美试剂有限公司)；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)；DDAH2抗体(Santa Cruz公司)；PRMT1抗体(Cell Signaling公司)；兔抗β-actin抗体(北京博奥森公司)；羊抗兔IgG-HRP抗体(Cell Signaling公司)。

1.3动物 Sprague-Dawley大鼠60只，SPF级，雌雄各半，体重(250±20)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK(宁)2009-0001，预养1周后进行实验。

2 方法

2.1实验分组及模型建立 将60只大鼠随机分为5组，即正常对照组、模型组(ISO，5 mg·kg-1)、苦参碱预防给药组(100 mg·kg-1、50 mg·kg-1和25 mg·kg-1)。参照文献[12]建立大鼠慢性心力衰竭模型，将模型组和苦参碱预防给药组大鼠按5 mg·kg-1皮下注射ISO，每天1次，连续7 d给药，而正常对照组给予等体积的生理盐水7 d。在ISO给药1 h前，苦参碱预防给药组大鼠分别按100 mg·kg-1、50 mg·kg-1、25 mg·kg-1灌胃苦参碱，每天1次，连续7 d，而正常对照组、模型组大鼠按等体积生理盐水灌胃。

2.2心脏血流动力学参数测定 各组大鼠于末次给药24 h后，用20%乌拉坦按6.5 mg·kg-1腹腔注射将其麻醉，固定于鼠台上，用生物电信号电极引导大鼠标准Ⅱ导联心电图，用以观察心率、心肌肥大以及心肌缺血情况。接着切开颈部皮肤，分离右颈总动脉，经颈动脉切口处向心脏方向插入预充肝素(含肝素500 U·mL-1)的PE50心导管，导管另一端经压力换能器与MPA心功能分析系统相连接。心导管插入至左心室稳定10 min后记录左心室收缩压(LVSP)、左心室终末舒张压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(LVdP/dtmax)和左心室内压最大下降速率(LVdP/dtmin)等血流动力学参数5 min，完后导管退出左心室进入颈动脉，记录收缩压、舒张压5 min，将随机取其1 min平均记录值作为实验结果。

2.3组织样本处理与检测 心功能检测完成后，颈动脉取血，室温下静置1 h后低温离心(4 ℃，3500 r·min-1，10 min)分离血清，-20 ℃冰箱保存备用；随后开胸摘取心脏经液氮中速冻后，-80 ℃冰箱保存备用。

2.4血清cTnI、BNP、ADMA测定 取-20 ℃冰箱保存的大鼠血清，cTnI、BNP、ADMA测定按其试剂盒说明书进行统一稀释后加样，加样完成后孵育，用酶标仪(Bio-Rad公司)于450 nm处测定吸光度(OD)值，上述所有测定依据各标准品实验结果分别绘制标准曲线，然后求出各组大鼠血清cTnI、BNP、ADMA的含量。

2.5Western blot检测 取适量冻存心肌组织，经液氮研磨后，提取组织蛋白，测定蛋白含量，并统一稀释后加入SDS-PAGE上样缓冲液置沸水中煮8 min，室温冷却后，4 ℃冰箱保存备用；制备4%浓缩胶及10%或7.5%分离胶，加入蛋白样品，上样量为45 μg，电泳分离蛋白质后，转印蛋白于硝酸纤维素膜；载有蛋白的硝酸纤维素膜经5%脱脂牛奶封闭后，加入PRMT1(1∶200)，DDAH2(1∶200)及内参照β-actin(1∶1000)等一抗4℃过夜，经PBST换洗后，加相应二抗孵育，加发光剂，暗室压X线片曝光后洗印，扫描照片，条带扫描结果经Quantity one软件分析，计算净OD值。将目的条带的OD值与其相对应的内参β-actin的OD值相比以校正误差，所得比值代表该目的蛋白的相对含量。

3 结果

3.1苦参碱对CHF大鼠血流动力学的影响 如表1所示，与正常对照组比较，ISO组大鼠LVSP和LV dP/dtmax分别降低了21.0%和39.1%，LVEDP和LV dP/dtmin分别升高了74.2%和33.3%，差异有显著性(P<0.01)，HR和SAP较正常组显著下降(P<0.05)，提示模型大鼠心功能处于失代偿期，且心输出量降低。与ISO组比较，苦参碱(100，50和25 mg·kg-1)预防给药组大鼠血流动力学指标LVSP和LV dP/dtmax均显著增加(P<0.01)，而LVEDP和LV dP/dtmin显著降低(P<0.01)，表明苦参碱具有改善ISO诱导CHF大鼠左心室功能障碍的作用；HR和SAP较ISO组显著提高(P<0.05)，但DAP在各实验组之间无显著性差异。

3.2苦参碱对ISO诱导CHF大鼠血清cTnI、BNP、ADMA的影响 如表2所示，与正常对照组比较，ISO组大鼠血清cTnI(P<0.01)、BNP(P<0.01)和ADMA(P<0.05)含量分别升高，表明小剂量ISO可诱导大鼠心功能不全和心肌损伤，其发生可能与血清ADMA水平升高有关；与ISO组比较，苦参碱(100 mg·kg-1·d-1,50 mg·kg-1·d-1和25 mg·kg-1·d-1)预防给药组大鼠血清cTnI、BNP、ADMA水平显著降低，显示苦参碱对ISO诱导的CHF大鼠心功能、心肌损伤具有保护作用，其与降低大鼠血清ADMA含量有关。

3.3苦参碱对ISO诱导CHF大鼠心肌组织中PRMT1和DDAH2蛋白表达水平的影响 Western blot检测结果显示，ISO组大鼠心肌组织内PRMT1蛋白表达较正常对照组明显增加(P<0.01)，而DDAH2蛋白表达呈明显降低(P<0.01)，这表明PRMT1和DDAH2在ISO诱导的大鼠慢性心力衰竭中发挥重要作用。与ISO组比较，苦参碱(100 mg·kg-1·d-1,50 mg·kg-1·d-1和25 mg·kg-1·d-1)预防给药组心肌组织DDAH2蛋白表达明显增高(P<0.01)，但PRMT1蛋白表达与ISO组无显著性差异，这表明苦参碱通过下调CHF大鼠心肌组织内DDAH2表达，促进体内ADMA分解代谢，从而降低血清ADMA水平，详见图1。

vs.正常对照组，▲P<0.05;▲▲P<0.01;vs.ISO组,**P<0.01

4 讨论

本研究结果表明，苦参碱(100 mg·kg-1、50 mg·kg-1和25 mg·kg-1)可显著改善ISO诱导的CHF大鼠心脏血流动力学异常变化和降低血清cTnI、BNP水平，显著上调心肌组织ADMA分解代谢通路中DDAH2蛋白表达，促进ADMA在大鼠体内的分解代谢，进而显著降低CHF大鼠的血清ADMA水平。因此，本研究认为苦参碱具有明显地改善心功能和心脏保护作用，其机制可能与调控心肌组织ADMA代谢途径有关。

ISO是众所周知的心脏毒性药物，可造成心肌弥漫性坏死、心肌肥厚和心肌纤维化[13]。本实验采用ISO(5 mg·kg-1·d-1，7 d)皮下注射的方法建立大鼠CHF模型，这种模型由于没有持续存在的损伤因素(如瓣膜疾病、冠状动脉结扎、病毒等)，所以能够更好地反映心衰的自然病理过程[11]。心肌重构是CHF发生发展的基本机制，可导致心肌局部舒缩性能和兴奋传导性能发生障碍，心肌僵硬度增加，心脏顺应性下降，从而影响心脏充盈和射血效率，心输出量随之减少[1]。LVSP、LV dP/dtmax和LVEDP、LV dP/dtmin是评价心肌收缩性和舒张性的重要指标[11]。cTnI是心肌损伤高度敏感和特异的指标，而BNP是评估充血性心力衰竭的重要指标[14-16]。本实验采用上述指标评估5 mg·kg-1ISO诱导的大鼠CHF模型，结果显示CHF模型大鼠LVSP、LV dP/dtmax较正常对照组显著降低和LVEDP、LV dP/dtmin较正常对照组显著降低显著升高，提示ISO组大鼠发生左心室收缩功能和舒张功能障碍；SAP和HR较正常对照组显著降低，提示ISO组大鼠心功能处于失代偿期，不能够向全身供应充足的血流量，表明ISO诱导大鼠CHF模型复制成功。另外本实验结果还显示模型大鼠血清cTnI和BNP的含量较正常对照组显著明显升高，进一步证实大鼠CHF模型复制成功，同时还表明CHF大鼠存在心肌损伤，这与先前的研究结果一致[17-18]。给予苦参碱(100、50和25 mg·kg-1)可以显著改善血流动力学紊乱和降低血清cTnI和BNP水平，表明苦参碱对ISO诱导的CHF大鼠心肌损伤和心功能障碍具有保护作用。

ADMA不仅是参与心力衰竭发生和发展的新型心血管危险因素，而且被认为是较目前心力衰竭标志物BNP更敏感的标志物[19]。ADMA是以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，主要由精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)催化蛋白或多肽中的精氨酸残基甲基化，然后甲基化蛋白或多肽在蛋白水解酶(DDAH))的作用下生成的[19]。迄今为止，发现了两种DDAH的亚型(DDAH-1和DDAH-2)，DDAH1主要存在于表达nNOS的组织中，而DDAH2主要存在于表达eNOS或iNOS的心血管组织中[20]。因此，心肌组织ADMA的生产和消除与PRMT1和DDAH2密切相关，PRMT1表达的降低或DDAH2表达增多均可以使体内ADMA的生成减少[21]，二者是ADMA合成与分解代谢通路中的两个关键限速酶。本研究结果显示，ISO致心力衰竭大鼠心肌组织PRMT1的表达较正常对照组显著增高，而DDAH2蛋白表达较正常对照组显著显著降低，其血清ADMA水平较正常对照组显著升高，表明ISO诱发CHF大鼠血清ADMA水平的增加与调控心肌组织PRMT1和DDAH2蛋白表达有关。另外，本研究显示血清ADMA水平的升高与BNP和cTn-1的升高呈正相关，表明ADMA作为一种新的心血管危险因子参与了ISO致大鼠CHF的病理机制。苦参碱(100,50和25 mg·kg-1)预防给药7天后可显著降低了CHF模型大鼠升高的血清ADMA水平，并显着上调了ISO所致心力衰竭大鼠中DDAH2的蛋白表达。然而，对ISO所致心力衰竭大鼠心肌组织PRMT1蛋白表达上调无显著抑制作用，表明苦参碱通过上调ADMA代谢通路中DDAH2蛋白表达，促进ADMA的分解代谢，从而发挥对ISO诱导的大鼠慢性心力衰竭保护作用。

综上所述，苦参碱具有保护ISO诱导大鼠慢性心力衰竭的作用，该作用机制与其降低血清cTnI、BNP和ADMA水平以及上调心肌组织ADMA代谢通路中DDAH2蛋白表达有关。