钛表面新型抗菌涂层的生物相容性研究

庞诗梦，夏 荣，李趁趁，余金兰

种植义齿修复具有成功率高、不损伤邻牙等优点，是替代缺失牙的金标准[1]，被称为“人类的第三副牙齿”[2]。而钛基材料本身不具备抗菌性能，若发生微生物感染，则可能导致种植体周围疾病，是导致种植失败的主要因素之一[3]。近年来有学者通过在种植体表面上制备纳米粒子涂层以达到抗菌效果[4-5]；Faramarzi et al[6]将米诺环素与种植体相结合，3个月内种植体周围牙龈卟啉单胞菌的数量明显减少；Carinci et al[7]研究了涂覆聚二甲基硅氧烷/葡萄糖酸氯己定(polydimethylsiloxane/chlorhexidine gluconate,PDMS/CHG)内涂层的种植体的抗菌性，结果表明该涂层具有良好抗菌性能，但无法持续释放药物。该研究拟在钛片表面构筑PDMS/CHG复合涂层，模拟愈合基台高度光滑的表面，观察该复合涂层不同浓度下对成纤维细胞的影响，探究涂层的生物相容性，以期为今后在愈合基台表面构建抗菌涂层提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂医用钛片TA1(宝鸡泰宇鑫金属材料有限公司)；聚二甲基硅氧烷Sylgard 184(美国Dow Corning公司)；葡萄糖酸氯己定溶液(美国Sigma公司)；SU8220冷场发射扫描电子显微镜(日本株式会社日立制作所)；LSM880激光扫描共聚焦显微镜(德国Carl Zeiss公司)；多功能微孔板酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；大鼠牙龈成纤维细胞及专用培养基(中国普诺赛生命科技有限公司)；CCK-8试剂盒(中国赛国生物科技有限公司)；AO/EB双染剂盒(中国贝博生物科技有限公司)；FITC标记鬼笔环肽(中国索莱宝生物科技有限公司)；DAPI、抗荧光淬灭封片液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 涂层的制备将直径12 mm，厚1 mm的钛片抛光至7 000目，放入丙酮、无水乙醇和超纯水中超声荡洗，各30 min，烘干，采用系统抽样将其随机分为5组。钛组：空白对照组；PDMS组：仅用PDMS处理组；C1组：用PDMS和0.2 mg/ml CHG处理组；C2组：用PDMS和0.4 mg/ml CHG处理组；C3组：用PDMS和0.8 mg/ml CHG处理组。

PDMS预聚体和交联剂按质量比10 ∶1混合，将PDMS组、C1组、C2组、C3组钛片放入浸泡，烘干。再将C1组、C2组、C3组钛片分别放入0.2、0.4、0.8 mg/ml CHG溶液中浸泡，冲洗，烘干，环氧乙烷灭菌。

各组随机抽取3枚钛片，利用扫描电子显微镜(scanning electron micrograph,SEM)观察表面微观形貌，检测涂层是否成功涂覆；随机抽取2枚钛片的各3个区域，用X射线能谱仪(energy dispersive spectroscopy,EDS)分析表面元素。

1.3 大鼠牙龈成纤维细胞的准备大鼠牙龈成纤维细胞(rat gingival fibroblasts,RGFs)使用专用培养基培养，传代至3～5代时进行实验。将细胞置于5%CO2，95%空气，37 ℃培养箱中培养，密度达到80%左右时进行细胞接种。

1.4 细胞骨架染色实验每组随机取5枚钛片分别放入24孔板内，将第3代RGFs按每孔1×104个细胞接种至钛片表面，放入细胞培养箱培养12 h后，弃掉板内旧的培养液，PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定10 min，用0.5% TritonX-100透化处理5 min，加入100 nmol/L FITC标记的鬼笔环肽工作液染色30 min，再加入DAPI复染细胞核，倒置在载玻片上，激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)下观察。

1.5 AO/EB染色实验每组随机取5枚钛片，将细胞按照每孔1×104个细胞接种至钛片表面，培养24 h后，每孔加入染色缓冲液500 μl，再各加入5 μl AO和5 μl EB，室温放置10～20 min，CLSM下观察。

1.6 细胞增殖实验每组随机取5枚钛片，将细胞按照每孔1×104个细胞接种至钛片表面，培养1、4、7 d后，从各组随机选取3枚钛片，每孔加入1 ml新鲜的培养基，并加入100 μl CCK-8试剂，放入37 ℃恒温箱中孵育4 h，每孔吸取200 μl加入96孔板中，设3个平行重复孔，最后用酶标仪测450 nm处的吸光度(optical density,OD)值。

2 结果

2.1 扫描电子显微镜观察各涂层组钛片表面扫描电镜图见图1，钛组表面可看到少量划痕；PDMS组表面形成了一层有少量裂纹的膜；C1、C2组表面虽形成了均匀的PDMS/CHG膜，但不够致密；C3组钛片表面组形成了均匀且致密的PDMS/CHG膜。钛片表面元素分析见图2，A～C、D～F分别为2枚钛片不同区域，结果显示同1枚钛片各区域均含有Cl元素，且含量大致相等，证明PDMS/CHG涂层涂覆成功。

图2 钛片表面EDS分析图

2.2 细胞骨架染色结果细胞接种12 h后，在CLSM下观察各组钛片表面细胞骨架的形态。各组细胞沿着各个方向伸展，均匀铺开，周围见伪足伸出，见图3。

图3 CLSM下各组钛片表面细胞骨架染色图像 ×40 oil

2.3 AO/EB实验结果细胞接种24 h后，AO/EB染色，在CLSM下观察各组钛片表面细胞情况。各组都有大量绿色荧光，仅可看到极少数红色荧光，见图4。

图4 各组钛片表面活死细胞情况 ×200

2.4 细胞增殖结果各组钛片表面细胞培养1、4、7 d，随着时间推移，各组OD值都在逐渐增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

图5 各组钛片表面细胞增殖情况

3 讨论

当种植修复日渐成为人们心中的最佳修复方式，种植体周围疾病也得到了学者们的极大关注，它包括种植体周围黏膜炎和种植体周围炎。由于在种植修复过程中细菌的繁殖是不可避免的，而细菌负荷又是导致种植体周围炎的重要因素，最终甚至会出现种植体松动、移位、脱落等。基台和种植体之间的间隙较易滋生病原菌[7]，因此预防种植体和基台连接处微生物感染是维持种植体长期稳定的关键[8-11]。

近年来，学者致力于种植体表面抗菌涂层的研究，但部分抗菌涂层生物相容性通常较差，甚至可能存在细胞毒性并导致内脏器官损伤[12]。由于CHG具有类似于抗生素的特性，且不易导致细菌耐药，在口腔诊疗中广泛应用。除此之外，CHG能杀灭真菌和细菌，但不能破坏孢子或分歧杆菌，在较低浓度下，CHG可以引起革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞内钾离子和戊糖的释放，达到杀菌的目的，而浓度较高的CHG会导致细菌细胞壁形成不可逆的损伤，因此本研究选用CHG作为抗菌成分，探究其不同浓度的生物相容性。PDMS涂层是一种新型的涂层，是一种疏水类有机硅物料，在药品、日化用品、食品、建筑等各领域均有应用。PDMS通过聚硅氧烷链和钛表面的-OH官能团的相互作用与钛表面结合，硅氧烷则可通过范德华力捕获CHG分子，使它们在与水介质接触后缓慢释放[13]。Lauritano et al[13]报道内腔涂覆PDMS/CHG涂层的种植体能有效抑菌，结果显示，48 h内仅有0.3%的细菌污染种植体-基台连接处的外表面。

本研究采用PDMS与CHG结合的方式制备PDMS/CHG复合涂层，利用AO/EB活死细胞染色试剂盒和CCK-8试剂盒检测活死和增殖情况，结果表明实验所选各浓度的CHG均呈现良好的增殖效果和活死比例，说明CHG浓度不超过0.8 mg/ml的PDMS/CHG不会抑制细胞的生长。随后利用FITC标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，结果显示，各组钛片表面细胞在共聚焦显微镜下伸展形态良好，细胞骨架清晰，呈梭形，且有伪足伸出。提示PDMS/CHG在CHG浓度不超过0.8 mg/ml时，具有良好的生物相容性。

本研究使用高度抛光的钛片模拟了愈合基台表面光滑的形态。在临床应用过程中，可将该涂层制备在愈合基台上，在不破坏种植体表面结构的前提下，达到抗菌的目的，且在复诊过程中可随时更换，降低了成本，节省了时间，并且方便后续灭菌和使用。相较于之前研究中将复合涂层涂覆于植体内腔的方案，减少了试剂对种植体本身的损害，不仅解决了内腔涂层无法使药物释放达到最佳浓度的问题，同时由于本涂层在愈合基台外表面，种植体-基台连接处间隙也不会因此增大而使细菌更容易定植。

本研究有一定的局限性，仅选用成纤维细胞进行实验，而牙周组织是由多种不同的细胞、纤维共同形成的，因此，后续会进一步对其他细胞的相容性进行研究，并模拟口腔内状态，以得到更加全面的理论支持；拟进行动物实验，探究该涂层的抗菌性及生物相容性，为体内实验提供依据；同时也需将涂层的制备工序进一步优化，使得涂层更加稳定和有效。

种植体抗菌涂层的研究进展迅速，在预防种植体周围疾病方面有重要意义，前景广阔，但由于大部分研究都停留在体外实验和动物实验阶段，因此，尚需要更多的基础及临床研究来推动这一技术的发展。