血管内皮生长因子和临床特征对弥漫性大B细胞淋巴瘤的预后影响

沈子园，贺晨露，闫冬梅，王祥民，孙 财，桑 威，黄水平，孙 晗

作者单位：1徐州医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，徐州 2210042徐州医科大学附属医院血液科，徐州 221006

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，通过自分泌/旁分泌方式特异地作用于血管内皮细胞上的受体，由肿瘤细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞所合成。其可诱导血管生成，以维持或恢复细胞局部氧和营养供应所需的毛细血管网的增殖和扩张，减少局部组织缺血[1-2]，在多种癌症血管生成和进展中起着重要作用[3]。弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型。由于DLBCL的高度异质性，其预后因患者年龄，临床病理特征和遗传因素而异。基于临床变量的国际预后指数(international prognostic index，IPI)是预测DLBCL患者预后的常用模型[4]。目前，探讨VEGF水平对DLBCL预后影响的相关报道较少，因此该研究回顾性收集了203例初诊为DLBCL且具有VEGF确切数值的患者数据，以探讨VEGF对预后的影响。

1 材料与方法

1.1 病例资料回顾性收集2012年11月—2021年1月徐州医科大学附属医院收治的经病理诊断确诊为DLBCL的患者共203例。患者均为初诊，具有明确病理诊断，且通过查体、手术或影像学检查确定肿瘤侵犯部位，采用Ann Arbor分期系统，每例均登记临床资料，包括性别、年龄、临床分期、IPI，乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)和白蛋白(albumin，Alb)等指标。并通过胸腹部CT平扫、B超定位明确患者有无肝、脾、浅表淋巴结肿大，同时收集患者免疫组织化学分析的结果，如MYC、BCL-2、BCL-6、细胞起源(GCB/Non-GCB)和Ki-67等。

1.2 实验方法收集患者外周血样3 ml于EDTA抗凝管中，所有样品在3 500 r/min离心10 min，取出分离血清采用酶联吸附法进行VEGF水平测定，根据制造商使用说明，使用VEGF ELISA试剂盒(北京健平金星生物科技有限公司)测定血清VEGF水平。用BIOBASE全自动酶免工作站(山东博科生物产业有限公司)进行双波长进行测定，依据校准品测量值与浓度绘制出标准曲线，然后根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度，参考值范围为0.00～142.2 pg/ml。

1.3 随访通过查阅患者电子病历及纸质病史记录，确认患者住院治疗情况，对患者进行电话随访，随访时间截至2021年7月15日。总生存期(overall survival，OS)定义为患者确诊DLBCL到任何原因死亡或随访结束之间的时间间隔。

1.4 统计学处理计量资料采用中位数(四分位数间距)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料采用n(%)表示，组间比较采用Pearson χ2检验。对连续变量采用基于MaxStat统计量的方法，以确定其最佳截断值(cut-off)。预后分析采用Kaplan-Meier曲线，组间比较使用Log-rank检验，采用Cox比例风险模型进行单因素、多因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析采用SPSS和R软件。

2 结果

2.1 一般资料203例患者中男性104例(51.2%)，女性99例(48.8%)，年龄14～87(58.25±13.42)岁，98例患者超过60岁，LDH升高90例(44.3%)，Ann Arbor分期Ⅲ/Ⅳ期97例(47.8%)，38例患者的Ki-67≥90%，27例(13.3%)患者中枢受累，CD5阳性患者43例，患者的基线特征如表1所示。

表1 203例DLBCL患者一般资料

2.2 生存分析截止至随访结束时，死亡67例(33.0%)，病人的中位随访时间为37.6个月(95%CI：35.712～39.555)，5年OS为62%，患者的生存概率曲线如图1所示。

图1 203例DLBCL患者的生存曲线图

对两组患者临床表现及实验室检查数据进行统计学分析，Mann-Whitney U检验结果表明VEGF、年龄、红细胞计数、血红蛋白、血小板、白蛋白、β2-MG、LDH和纤维蛋白原在存活组与死亡组之间的数值差异有统计学意义(P<0.05，表2)。Pearson 2结果表明BCL-2、中枢受累、肝脾肿大、Ann Arbor分期、ECOG评分和IPI评分组间差异有统计学意义(P<0.05)，大包块、CD5、BCL-6和骨髓受累组间差异无统计学意义。

2.3 VEGF及其它连续变量的最佳截断值的确定基于MaxStat统计量(图2)计算出VEGF、白蛋白、β2-MG、红细胞计数、血红蛋白、乳酸脱氢酶和年龄的最佳截断值分别为266.8 pg/ml、40.6 g/L、1 708 μg/L、3.82×1012/L、103 g/L、668 U/L和57岁。

2.4 生存分析

2.4.1单因素、多因素分析 单因素分析表明DLBCL的预后受多种因素的影响：VEGF、红细胞计数、Alb、ECOG评分、血红蛋白、Ann Arbor分期、LDH、β2-MG、B症状、中枢受累、年龄、大包块和BCL-2(P<0.05)。将上述变量引入Cox模型采用向前逐步法进行多因素分析，结果表明VEGF、红细胞计数、血红蛋白和白蛋白是预后的独立影响因素(表3)。

表2 计量资料组间差异Mann-Whitney U检验

图2 基于MaxStat统计量获得患者VEGF的最佳截断值

表3 DLBCL患者预后影响因素分析

2.4.2VEGF和临床病理特征的相关分析 课题组分析了VEGF水平和临床病理的相关性，结果表明VEGF较高的患者伴有更高的Ann Arbor分期、ECOG评分、IPI得分、BCL-2阳性和MYC阳性表达(P<0.05)，但在细胞起源和BCL-6表达中未见差异(表4)。

进一步分析不同VEGF水平的患者在Ann Arbor分期、ECOG评分、IPI不同风险组、BCL-2和MYC表达中的生存情况。结果表明，在总体患者中VEGF<268.8时患者的生存情况较好，低VEGF的患者5年OS为65.5%，而高水平的VEGF患者5年OS仅为38.7%(图3A)。此外，Ann Arbor分期中Ⅲ/Ⅵ期，ECOG<2分，IPI低危组，BCL-2阴性表达和MYC阳性表达组中的低VEGF水平患者的生存结局较好(图3B～F)。

图3 不同水平的VEGF患者组间生存分析

表4 不同VEGF水平和临床病理的组间差异分析[n(%)]

3 讨论

VEGF是1999年Gerber et al[5-6]从牛垂体星状细胞外分离而成的一种糖蛋白，具有刺激内皮细胞分裂、增生、促进内皮细胞移行和增强血管通透性等生物学效应。VEGF可通过旁分泌作用于内皮细胞上的VEGF受体(VEGFR)，还可通过自分泌与肿瘤细胞上的VEGFR结合促进肿瘤细胞增殖，同时抑制其凋亡，在实体肿瘤血管生成及肿瘤细胞迁移、侵袭等方面均发挥重要作用[7]。DLBCL由于其具有高度的侵袭性与异质性，患者的临床表现、肿瘤的病理形态及生物学特征等存在巨大差异且预后效果差异很大[8]。近几年，关于血管再生与相关肿瘤疾病的研究取得了一定的进展，且血管生成对于肿瘤的恶变、生长、转移等方面至关重要，其中有研究[9]显示，VEGF水平的高表达与肿瘤细胞侵袭转移有明显相关。本回顾性研究通过分析203例初诊DLBCL患者的临床数据，表明VEGF水平是DLBCL患者的独立预后因素，VEGF水平升高的患者生存情况明显较差。

VEGF参与生理性血管发育，其在不同的病种中表达水平存在差异，基于实验室ELISA法测定VEGF的参考范围为0.00～142.2 pg/ml，本研究基于MaxStat计算出VEGF在DLBCL中的最佳截断值为266.8 pg/ml，且VEGF<268.8 pg/ml的患者生存情况明显高于VEGF水平增高的患者。此外分析表明存活组与死亡组患者的VEGF水平比较也存在差异，死亡组患者的VEGF水平高于存活组患者的VEGF，且差异有统计学意义。同时，存活组与死亡组DLBCL患者之间的年龄、红细胞计数、血红蛋白、血小板、白蛋白、β2-微球蛋白、LDH、纤维蛋白原、BCL-2阳性表达、中枢受累、肝脾肿大、Ann Arbor分期、ECOG评分和IPI评分组间也同样存在差异。

本研究结果表明，高水平的VEGF是DLBCL患者的独立不良预后因素，此外多因素分析提示红细胞计数、白蛋白过低，血红蛋白过高，年龄较大的患者预后情况较差，这与先前的研究结果基本一致[10-12]。DLBCL的临床病理有着显著的特异性，先前的研究[8,13]表明生发中心起源的患者预后情况优于非生发中心起源的患者，CD5阳性表达的DLBCL患者预后情况较差。本研究中进一步分析VEGF水平与临床病理的相关性，VEGF较高的患者伴有更高的Ann Arbor分期、ECOG评分、IPI积分、BCL-2阳性和MYC阳性表达。KM分析表明Ann Arbor分期中Ⅲ/Ⅵ期、ECOG<2分、BCL-2阴性表达和MYC阳性表达组中的低VEGF水平患者的生存结局均较好。此外，本研究进一步证实了课题组之前的一项小样本研究结果，VEGF可以对IPI评分中低危组患者的生存情况进行更加精细的划分[14]。

综上所述，这项回顾性的临床研究证实了治疗前的VEGF水平与DLBCL患者的预后有关，并且确定了影响DLBCL预后的VEGF的最佳截断值，基于该截断值，可以对不同的细胞起源、IPI、ECOG、BCL-2阴性表达组患者再分层，证明了高水平的VEGF对DLBCL预后的影响。但本研究为单中心、回顾性分析，尚需开展前瞻性、多中心临床研究以探讨VEGF水平在DLBCL预后判断中的作用。