壳聚糖-细菌纤维素复合膜的制备及其生物相容性的研究

肖剑虹，赵正宜，邹多宏,2

作者单位：1安徽医科大学口腔医学院，安徽医科大学附属口腔医院，安徽省口腔疾病研究重点实验室，合肥 2300322上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔外科，上海市口腔医学重点实验室，上海 200001

引导骨再生(guided bone regeneration, GBR)技术是临床上治疗牙槽骨缺损常用且有效的方法之一。其中，GBR屏障膜在阻止成纤维细胞和上皮细胞等非成骨细胞长入骨缺损区和维持骨修复所需要的空间等方面起到重要作用。目前临床上应用的可吸收性屏障膜机械强度不足，在骨缺损修复的过程中容易发生穿孔和破裂，不利于屏障功能的实现和骨修复空间的维持，从而导致骨修复效果不佳[1]。因此，研发出一种具有足够力学性能的屏障膜，尤其是在体内湿态环境下还能维持足够的力学强度，以维持骨再生所需要的空间是目前发展GBR技术的当务之急。该研究在壳聚糖(chitosan, CS)基质中引入细菌纤维素(bacterial cellulose, BC)，并通过自蒸发方法制备出CS-BC复合膜，通过测试该复合膜在干态和湿态下的拉伸强度及其对大鼠骨髓干细胞增殖的影响，探究其作为GBR膜的可行性。

1 材料与方法

1.1 合成材料中低黏度CS(100～200 Mpa.s，脱乙酰度≥95%，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)。细菌纤维素(生化级，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)

1.2 主要试剂与仪器胎牛血清(美国Gbico公司)；达尔伯克改良伊格尔培养基(美国Gbico公司)；胰酶消化液(美国 Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(日本株式会同仁化学研究所)；冰乙酸和氢氧化钠(北京国药集团化学试剂有限公司)；二氧化碳孵育箱(美国Thermo公司)；高温高压灭菌锅(HVE-50, 日本Hirayama公司)；酶标仪(美国Bio-tek公司)；超声破碎机(JYD1800L, 上海比朗仪器有限公司)；力学万能测试机(5565A, 美国英斯特朗公司)；扫描电子显微镜(Supra 40，德国蔡司公司)；透射电子显微镜(HT7700, 日本日立公司)；傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 8700， 美国热电尼高力仪器公司)；X 射线衍射仪 (X'Pert3 Powder，荷兰帕纳科公司)。

1.3 原料合成称取1 g CS粉末溶于98 ml去离子水中，边搅拌边往溶液中逐滴加入1 ml冰乙酸，搅拌至粉末完全溶解，配制出质量浓度为1%的CS溶液，离心除气泡备用。

1.4 复合膜的制备首先制备CS ∶BC质量分数为10 ∶1的复合膜，取100 g 1% CS溶液和20 g 0.5% BC溶液，冰水浴中超声破碎至两者混合均匀，在真空干燥箱中除尽气泡后倒入培养皿中，放置于40 ℃加热台上待水分完全蒸发后成膜。将自蒸发所制备的膜浸泡于0.3 mol/L的氢氧化钠乙醇溶液中24 h，待酸除尽后用去离子水冲洗干净后一半干燥，另一半在去离子水中浸泡保持湿润状态备用。同理分别制备CS ∶BC质量分数为10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7和10 ∶9的复合膜以及纯CS膜(图1)。

图1 复合膜的制备过程示意图

1.5 力学性能测试将所制备的各组薄膜在室温下裁剪为长50 mm、宽3 mm 的样品(每组薄膜样品数量为6)。用螺旋测微器测量每个样品的厚度后，通过力学测试机在拉伸速度为0.01 mm/s的情况下拉伸样品至样品断裂，并记录其拉伸强度。每组膜干燥和湿润的样品均重复测试6次。绘制出各组膜分别在干态和湿态下的拉伸强度值表和应力应变曲线图，取拉伸强度最大的复合膜组及纯CS膜组进行后续实验。

1.6 样品表征取纯CS组和拉伸强度最大的复合膜组，用扫描电子显微镜观察其横截面的微观结构。将成品BC溶液稀释后滴于透射铜网的表面，待其完全干燥后经透射电镜观察BC的形貌。将BC溶液经自蒸发沉积后成膜，取纯BC膜、纯CS膜和拉伸强度最大的复合膜，采用傅立叶变换红外光谱仪和X-射线衍射仪分析其各组成分。

1.7 大鼠骨髓干细胞(rat bone marrow stem cells, RBMSCs)的分离及培养取3～4周龄体质量为(50±5) g的雄性SD大鼠(安徽医科大学实验动物中心)的两边股骨，用眼科剪将股骨两端剪去成两端相通，用1 ml的注射器吸取含20%胎牛血清的DMEM反复冲洗骨髓腔、离心、弃上清液后将沉淀的组织细胞重悬于大皿中培养，大皿中总体积为10 ml，标记为P0。5 d后首次换液，之后每3 d换1次液，待P0细胞融合至70%～80%后用胰蛋白酶消化传代。本实验所用的大鼠骨髓干细胞均为P3～P5代。

1.8 细胞相容性实验取纯CS组及干湿态力学性能最强组复合膜，用打孔器将薄膜制备为直径为6 mm的圆，每组至少15个样，经过高温高压灭菌后备用。取P3～P5代RBMSCs，分为空白对照组、纯CS膜组和复合膜组共3组，每组5个复孔，共3个时间段以5×103/孔的细胞密度接种于3个96孔板中。在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，待孔板中的细胞贴壁后，将灭菌好的薄膜材料分别加入3个96孔板中，空白对照组中不加任何薄膜。继续将96孔板置于培养箱中分别培养1、4、7 d。将CCK-8试剂与纯DMEM以1 ∶10的比例混合后，每孔加110 μl，培养箱中继续培养2 h后，用酶标仪读取每孔在波长为450 nm处的吸光度(optical density, OD)值。

2 结果

2.1 纯CS膜及各组复合膜在干态和湿态下拉伸强度的比较各组薄膜在干态和湿态下的拉伸强度值和应力应变曲线图如图2。随着BC含量增加，CS-BC复合膜在干湿态下的拉伸强度随之增加，在CS ∶BC为10 ∶7时，拉伸强度达到最大，干、湿态的拉伸强度分别为(204.7±63.0)、(44.4±6.4) MPa，远远大于临床上最常用的Bio-Gide膜在干、湿状态下的力学性能约为3.7、1.16 MPa，之后随着BC含量增加，拉伸强度开始下降。

2.2 样品表征纯CS膜和CS ∶BC质量分数为10 ∶7的复合膜横截面的扫描图如图3所示。纯CS膜为均一的有机质结构，复合膜中可见BC的纤维撕扯样结构。透射电镜示BC的纳米纤维样结构(图4)。傅立叶变换红外光谱图和X-射线衍射图中示复合膜中存在CS和BC(图5)。

2.3 细胞相容性实验选取纯CS膜和CS ∶BC质量分数为10 ∶7时的复合膜进行细胞相容性实验。图6结果显示，纯CS组和复合膜组与RBMSCs共培养1 d (F=3.590，P=0.060)、4 d (F=0.293，P=0.751)和7 d (F=1.737，P=0.217)后，在同一个时间段内，各组OD值差异无统计学意义。基于此结果，本实验所制备的复合膜具有优良的细胞相容性。

图2 纯CS膜、各组复合膜及Bio-Gide膜在干态和湿态下拉伸强度的比较

图3 横截面扫描电镜微观结构图

图4 BC在不同倍数下的透射电镜图

图5 CS-BC复合膜的傅立叶变换红外光谱图

图6 各组膜材料与RBMSCs共培养1、4和7 d后细胞计数的比较

3 讨论

临床上，GBR技术被广泛应用于因炎症、创伤、肿瘤摘除或者先天性疾病而引起的牙槽骨缺损的治疗[2]。该技术将一层屏障膜置于骨缺损和软组织之间来阻挡周围迁移过快的成纤维细胞和上皮细胞等软组织细胞长入骨缺损从而确保骨修复正常进行[3-4]。

目前临床上应用的GBR膜根据其降解性与否划分为不可吸收性膜和可吸收性膜。不可吸收性膜具有良好的生物相容性和足够的机械强度以维持骨缺损修复的空间，但是需要二次手术取出极大地限制了其临床应用[5]。可吸收性膜因具有良好的生物相容性、可降解性而广泛应用于临床。但是可吸收性膜力学性能不足可能会导致骨缺损预后不佳[6]。因此，理想的GBR膜除了应具有良好的生物相容性，还应具备足够的力学强度，以维持骨缺损修复的空间和防止膜的穿孔破裂。考虑到GBR膜的实际应用环境是在体内湿态环境下，所以GBR膜在湿润状态下的力学性能更是至关重要。

所以，本研究拟制备出一种具有良好的生物相容性，在干态和湿态下具有优异力学性能的新型GBR膜。CS因具备良好的生物相容性、可降解性和抑菌性而被广泛的应用于组织工程[7]。但是纯CS力学强度不够，常通过应用纳米复合材料、与聚合物混合以及通过化学交联等方法来提高CS的力学性能，但是这些提高CS机械强度的方法会影响到其生物活性，所以，如何做到在不影响CS生物活性的前提下提高其力学强度是当前的一个研究热点[8-9]。

BC是一种具有三维多孔网络结构的纳米纤维，因具有显著的物理性能(拉伸强度大)和优异的生物学性能(生物相容性和低毒性)作为一种生物医学材料而备受关注[10-11]。

因此，本研究以CS为主体，在CS体系中引入BC来提高复合膜的力学性能。通过超声破碎的方法将不同比例的CS和BC混合均匀后通过蒸发自沉积的方式制备出复合膜，将制备出来的复合膜使用氢氧化钠乙醇溶液浸泡除酸处理后备用。对所制备的各组复合膜在干态和湿态下进行拉伸强度的测试，可得在CS ∶BC为10 ∶7时，复合膜的拉伸强度达到最大，分别是(204.7±63.0) MPa (干态)和(44.4±6.4) MPa (湿态)。Bio-Gide膜作为临床上最常用的GBR膜之一，其在干湿态下的力学强度分别约为3.7 MPa和1.16 MPa[1]，远远低于CS-BC复合膜的力学强度。BC对CS力学性能的增强作用可能取决于以下两个方面：① BC本身所具有的显著的拉伸强度[12]；② BC具有高比表面积并且在CS基质中分散良好，有利于BC和CS间氢键形成[13-14]。取力学强度最大的复合膜组进行后续生物相容性的实验，实验组和空白对照组相比结果差异无统计学意义，说明复合膜具备良好的生物相容性。

综上所述，本研究通过构建CS-BC二元体系的复合膜，探究复合膜的微观结构，复合膜在干态和湿态下的力学性能以及复合膜的细胞相容性。实验结果显示，所制备的新型复合膜在干态和湿态下均具有较好的拉伸强度且具有优异的生物相容性，有望作为新型的GBR膜而应用于临床。