lncRNA CASC2通过调控miR-218-5p表达对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞炎症反应及迁移与侵袭的影响

李 梅，蒋锦梅，欧大明，黄丽芳，谢立虎，张 济

作者单位：南华大学衡阳医学院附属第一医院 1风湿免疫科、2风湿免疫实验室，衡阳 421001

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫病，临床病理表现为以类纤维细胞样化和膜细胞增殖浸润，可导致滑膜增生和关节损害[1-2]。有研究[3-4]报道，lncRNA不仅在RA患者外周血或滑膜组织中表达异常，还能参与调控RA滑膜细胞炎症、增殖、迁移和侵袭。新的研究[5]显示，lncRNA CASC2(简称CASC2)在RA患者血浆中表达水平较低，且过表达CASC2可促进人RA滑膜成纤维细胞凋亡。同时，也有研究[6]发现，miR-218-5p在RA患者关节滑膜组织及骨性关节炎患者软骨组织中高表达。但CASC2在RA滑膜组织中的表达情况及其是否可通过靶向调节miR-218-5p参与RA进程的调控，目前还未知。因此，该研究旨在检测CASC2及miR-218-5p在RA患者滑膜组织中的表达水平，并探讨CASC2对RA滑膜成纤维细胞炎症反应、迁移、侵袭中的影响，以期为RA靶向治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞与试剂 人RA滑膜成纤维细胞系MH7A来源于日本Tsukuba公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自上海TBD公司；CASC2过表达质粒(pcDNA3.1-CASC2)及其空载质粒(pcDNA3.1-)购自武汉天一辉远生物公司；miR-218-5p模拟物(mimic)和阴性对照(mimic-NC)购自广州锐博公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin-6，IL-6)和IL-1β试剂盒购自美国Biovalue公司；基质胶购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒、BCA蛋白质检测试剂盒和双萤光素酶报告基因试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Introvigen公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser购自日本TaKaRa公司；GoTaq qPCR Master Mix试剂盒购自美国Promega公司； GAPDH抗体、MMP-2抗体、MMP-9抗体购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HPR)偶联的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；引物由武汉金凯瑞生物工程有限公司提供。

1.1.2临床组织标本 45例RA滑膜组织收集于2019年2月—2020年7月在我院进行膝关节滑膜切除术或膝关节置换手术的RA患者。同期18例健康滑膜组织取自无急性或慢性关节异常病史的非RA患者膝关节组织。所有患者均签署知情同意书，本研究获得本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1细胞培养、转染及分组 RA滑膜成纤维细胞MH7A用含10%的血清的RPMI-1640培养基进行培养，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。根据实验需要，将细胞MH7A以5×105个细胞/孔铺在6孔板中，当细胞密度达到70%～80%时，将细胞分为空白对照组(blank)、空载组(Vector，转染空载质粒)、CASC2过表达组(CASC2，转染CASC2过表达质粒)、CASC2+ mimic-NC组(共转染CASC2过表达质粒和mimic-NC)和CASC2+miR-218-5p mimic组(共转染CASC2过表达质粒和miR-218-5p mimic)。采用Lipofectamine 2000将CASC2过表达质粒、空载质粒pcDNA3.1、miR-218-5p mimic及mimic-NC转染至MH7A中，6 h后更换新鲜的完全培养基，继续放入培养箱48 h。

1.2.2qRT-PCR检测lncRNA CASC2和miR-218-5p表达 使用TRIzol试剂提取滑膜组织及转染48 h后的MH7A细胞中总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒将RNA逆转录成cDNA，并使用GoTaq qPCR Master Mix试剂盒进行PCR扩增。将10 μl qPCR混合物及每种引物0.5 μl混合均匀，配制成最终的20 μl反应混合物。用于扩增的热循环参数如下：94 ℃变性2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30s，40个循环；25 ℃ 5 min终止反应，构建熔解曲线并在62 ℃和95 ℃之间进行分析，采用2-△△Ct法计算CASC2和miR-218-5p相对于对照基因GAPDH或U6的表达水平。所用qPCR引物参照表1所示。

表1 qPCR引物

1.2.3CCK-8检测细胞增殖能力 取对数生长期MH7A细胞，调整细胞浓度为2×104个/ml，以100 μl/孔接种于96孔板中，放入培养箱中24 h，按照上述方法使用Lipofectamine 2000进行不同分组细胞转染，培养6 h后更换新鲜培养基继续孵育24、48、72 h。在各个时间点提前4 h每孔加入10 μl CCK-8工作液，置于培养箱4 h后采用酶标仪测定450 nm处的吸光度(optical density, OD)值，以OD值来评判不同分组的细胞增殖情况。

1.2.4ELISA检测 收集转染后不同分组的MH7A细胞上清液，根据TNF-α、IL-6和IL-1β试剂盒说明书分别检测上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.5Transwell检测细胞迁移、侵袭能力 消化转染后的MH7A细胞，用基础培养基调整细胞浓度为2.5×105个/ml，以100 μl/孔接种于上室中，下室加入700 μl含10% FBS的完全培养基。置于培养箱中24 h。弃培养基，取出小室用PBS清洗1次，加入固定液固定15 min，再用结晶紫染色15 min，擦除膜上方未穿过的细胞，晾干后使用显微镜观察迁移细胞情况并拍照记录。细胞侵袭实验需要提前在上室中平铺1mg/ml的基质胶，其他实验步骤同上。

1.2.6Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达 消化收集各组细胞，使用RIPA缓冲液冰上充分裂解30 min，然后以12 000 r/min离心15 min，收集上清液，再使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白质含量。取25 μg蛋白经沸水浴变性后，采用SDS-PAGE分离蛋白，再将蛋白转移到硝酸纤维素(PVDF)膜上，经5%脱脂奶室温封闭2 h，加入MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗在4 ℃下孵育过夜。去除抗体，经TBST洗涤3次(5 min/次)，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育1 h，经TBST洗涤3次后，滴加ECL显影液显色。目的蛋白相对表达量以目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值表示。

1.2.7荧光素酶报告基因验证miR-218-5p 生物信息学在线软件ENCORI预测CASC2与miR-218-5p靶向结合位点。设计并合成含miR-218-5p结合位点的CASC2野生型(Wt)和突变型(Mut)片段，并将其插入双荧光素酶报告基因载体，获得含有CASC2 Wt-3 ′-UTR和Mut-3 ′-UTR重组质粒。使用Lipofectamine 2000将miR-218-5p mimic及其阴性对照(mimic NC)与CASC2 Wt-3 ′-UTR或Mut-3 ′-UTR共转染至293T细胞中，48 h后收集细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书分别检测海肾萤光素酶活性(renilla luciferase，RLU)和萤火虫萤光素酶活性，相对荧光素酶活性=萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性。

2 结果

2.1 RA患者滑膜组织中CASC2和miR-218-5p表达水平qRT-PCR检测结果显示，在RA患者滑膜组织中CASC2的表达水平低于健康对照者，而miR-218-5p表达水平则高于健康对照者，差异性均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 CASC2和miR-218-5p在RA患者滑膜组织中表达

2.2 CASC2是miR-218-5p靶基因生物信息学在线软件ENCORI预测显示CASC2与miR-218-5p间存在靶向结合位点(图2A)。实验结果显示，与miR-NC组比较，miR-218-5p mimic可以降低CASC2-Wt荧光素酶活性(P<0.05)，而对CASC2-Mut荧光素酶活性无影响(图2B)。qRT-PCR实验数据(图3)显示，与blank组比较，CASC2组细胞中CASC2表达水平升高(P<0.05)，而miR-218-5p表达水平降低(P<0.05)。

2.3 CASC2过表达对MH7A细胞增殖的影响qRT-PCR检测结果显示，Vector、CASC2、CASC2+mimic-NC、CASC2+miR-218-5p mimic组细胞中miR-218-5p相对表达量分别为(1.01±0.07)、(0.16±0.13)、(0.17±0.11)和(0.77±0.08)，差异有统计学意义(P<0.05)。与Vector组比较，CASC2组细胞中miR-218-5p表达水平降低(P<0.05)；与CASC2组比较，CASC2+miR-218-5p mimic组细胞中miR-218-5p表达水平升高(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC组差异无统计学意义。CCK-8结果(如表2)显示，在24、48、72 h时间点，与Vector组比较，CASC2组细胞增值率降低(P<0.05)；与CASC2组比较，CASC2+miR-218-5p mimic组细胞增值率升高(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC组差异无统计学意义。

图2 CASC2与miR-218-5p在MH7A细胞系中的调控关系

图3 各组细胞中CASC2和miR-218-5p表达水平

表2 CASC2过表达对MH7A细胞增殖影响

组别24 h48 h72 hVector0.77±0.061.12±0.031.42±0.03CASC20.41±0.02∗0.71±0.05∗0.92±0.05∗CASC2+ mimic-NC0.43±0.040.71±0.080.93±0.09CASC2+miR-218-5p mimic0.70±0.03#1.00±0.04#1.25±0.03#F值60.08142.21155.142

2.4 CASC2过表达对MH7A细胞炎症因子分泌的影响ELISA结果(表3)显示，与Vector组比较，CASC2组炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P<0.05)；与CASC2组比较，CASC2+miR-218-5p mimic组炎症因子水平TNF-α、IL-1β和IL-6升高(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC组差异无统计学意义。

表3 CASC2过表达对MH7A炎症反应的影响(n=3，pg/ml)

2.5 CASC2过表达对MH7A细胞迁移和侵袭的影响如图4所示，与Vector组比较，CASC2组细胞迁移与侵袭数量明显减少(P<0.05)；与CASC2组比较，CASC2+miR-218-5p mimic组细胞迁移与侵袭数量明显增加(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC组差异无统计学意义。

2.6 CASC2过表达对MH7A细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的影响如图5所示，与Vector组比较，CASC2组细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与CASC2组比较，CASC2+miR-218-5p mimic组MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显增加(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC组差异无统计学意义。

3 讨论

RA是一种侵袭性、慢性自身免疫性疾病。RA滑膜成纤维细胞的异常激活是RA发生和发展的关键因素，并且RA滑膜成纤维细胞在一定炎性环境下会表现出类似肿瘤细胞的特性[7]。RA滑膜成纤维细胞能分泌许多炎症因子、促血管生成的细胞因子和生长因子，促进炎症发生和血管增生[8]，最终导致关节损坏。因此，探究RA发生的分子机制，寻找可行的分子靶点对RA的治疗非常重要。

已有研究[9]证实：lncRNA可作为RA的生物学标志物，参与RA滑膜成纤维细胞增殖、炎症反应、迁移和侵袭等过程。CASC2在多种肿瘤发生发展的过程中扮演着抑癌基因的角色，例如Li et al[10]研究发现促进CASC2表达可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。刘露 等[11]研究报道CASC2在神经胶质瘤细胞中过表达后可以抑制肿瘤发展。而关于CASC2在RA中的功能和作用机制的报道有限，并且其在滑膜组织中的表达情况尚未可知。Liu et al[7]研究显示CASC2在RA患者血浆中表达下调，且过表达CASC2可促进人RA滑膜成纤维细胞凋亡，其机制可能与下调IL-17水平相关。Sun et al[12]研究称，CASC2在OA患者软骨细胞中表达下调，其过表达可促进LPS暴露下软骨细胞的凋亡。由此可见，CASC2可能是治疗RA的潜在靶点。本研究显示RA患者滑膜组织中CASC2的低表达。实验结果显示，过表达CASC2可以抑制MH7A细胞的增殖能力，降低炎症因子水平，减弱细胞迁移及侵袭能力，下调MMP-2和MMP-9蛋白表达水平，可见CASC2可以作为治疗RA的潜在靶标。

图4 CASC2过表达对MH7A细胞迁移与侵袭的影响 ×200

图5 CASC2过表达对MH7A细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

miR-218-5p在多种肿瘤中发挥着抑癌的作用，例如Yang et al[13]研究表明，miR-218-5p通过靶向SHMT1抑制肺腺癌的进展。也有研究[14]发现miR-218-5p会导致癌症症状加剧，miR-218-5p在肺鳞状细胞癌组织和细胞中低表达，使肌动蛋白、胞外基质蛋白表达量增加，促进癌细胞的迁移与侵袭。目前，关于miR-218-5p在RA中作用机制的报道不多，Chen et al[15]研究发现miR-218-5p在RA患者关节滑膜组织高表达，沉默其表达可抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖。本研究显示在RA患者滑膜组织中miR-218-5p高表达，降低其表达可以抑制RA滑膜成纤维细胞MH7A的增殖活性，降低炎症因子水平，减弱细胞迁移及侵袭能力，下调MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。除此之外，本研究通过双荧光素酶报告证实CASC2与miR-218-5p之间存在靶向调控关系，miR-218-5p过表达可逆转CASC2过表达对RA滑膜成纤维细胞MH7A的增殖、炎症反应、迁移与侵袭的抑制作用。这一研究结果表明，CASC2靶向miR-218-5p影响细胞MH7A的增殖、炎症反应、迁移与侵袭。

综上所述，CASC2在RA患者滑膜组织中低表达，促进其表达可抑制RA滑膜成纤维细胞炎症反应及迁移与侵袭能力，其作用机制可能与靶向负调节miR-218-5p表达相关。这些发现可以为RA的靶向治疗提供参考靶点。