2种芽孢杆菌对克氏原螯虾幼虾生长的影响

陈玉玲，李志愿，李小平，王洪斌，王淑芳*

(1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港 222005；2.江苏省泗洪县大楼街道农业经济技术服务中心，江苏泗洪 223900)

随着国民生活水平的不断提高，对食品安全的要求也愈发严格。在水产品养殖安全的源头——饲料环节，微生物发酵饲料作为一种新型的生态健康型饲料，具有十分广阔的前景。2021年克氏原螯虾()产值超过4 000亿元，其新型健康养殖尚处于初级阶段。利用有益菌发酵饲料，改善饲料品质，提高饲料利用率，是目前研究的重要课题。王天神研究表明饲料中添加25%～35%的益生菌可以提高克氏原螯虾的生长性能；生物发酵饲料中的益生菌能够优化肠道中的微生物菌群，提高消化酶活性，提高饲料利用率，促进营养物质吸收，增强克氏原螯虾的特异性免疫和抗病能力。徐增洪等研究发现生物饲料对克氏原螯虾的生长和性腺成熟发育有显著影响(<0.05)，表明生物饲料对克氏原螯虾等水产动物养殖有较好的饲喂效果，它同时具有加快虾蟹生长速度和改善商品虾蟹品质的作用。地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌是发酵饲料中常用的微生物，对水产动物生长具有巨大的发展潜力。笔者用解淀粉芽孢杆菌()SS-42和地衣芽孢杆菌()10-2作为试验菌株，以不同菌浓度混合饲料饲喂克氏原螯虾幼虾，通过测定生长状况比较不同饲喂量不同菌株对克氏原螯虾生长的影响，以期为微生物发酵饲料在克氏原螯虾养殖中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

试验动物。克氏原螯虾购自赣榆某养殖场；试验所用饲料为某公司生产的膨化颗粒饲料。

试验菌株。解淀粉芽孢杆菌：SS-42菌株，从连云港紫菜养殖场养殖的紫菜中分离，由江苏海洋大学微生物实验室分离、纯化和保存。地衣芽孢杆菌：10-2菌株，从连云港紫菜养殖场养殖的紫菜中分离，由江苏海洋大学微生物实验室分离、纯化和保存。

菌种活化、摇床培养与稀释。用固体培养基活化SS-42和10-2菌株，在2216E固体培养基平板上三区划线后于28 ℃下培养活化。次日取单菌落转种于50 mL液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养18 h，使用血球计数板计数，梯度稀释至浓度10、10、10CFU/mL，待用。

试验处理设计。试验设置解淀粉芽孢杆菌SS-42和地衣芽孢杆菌10-2的3个浓度梯度[10、10、10CFU/(尾·d)]的处理组，3个解淀粉芽孢杆菌处理组为A、A、A，3个地衣芽孢杆菌处理组为B、B、B，每个浓度梯度重复3次，另外设置1个空白对照组(CK)，共21个处理。将不同浓度的菌液与饲料混合后投喂到相应养殖箱中，饲养期间每天统计死亡和出现残肢的克氏原螯虾数量，饲养结束后计算总死亡率、总残肢率和体重增长率等指标。

养殖管理。试验虾饲养在无毒塑料养殖箱(63 cm×53 cm×30 cm)中。水深5 cm，用增氧泵不间断充气。养殖用水是经过充分曝气的静置自来水，水中加入抗应激剂(0.003 g/mL)帮助适应环境，加入硫代硫酸钠(0.003 g/mL)和除氯、钙剂(0.007 g/mL)促进脱壳。外罩遮光度90%的遮阳网，养殖盆中加入遮蔽物供虾躲避和休憩。

从养殖场上购买的克氏原螯虾幼虾体长为(6.21±1.52)cm，体质量为(8.35±0.15)g，体色正常、反应活跃、体型相近。需先经过驯化处理，待虾适应实验室的养殖环境后挑取其中活力较强、腹肢齐全、体色鲜亮的个体放入编好号的养殖盆中，每个养殖盆中饲养10只虾。

每天投饲2次，分别为08：00和17：00，2次投喂比例为3∶7，按照虾平均体重的5%投喂饲料。饲喂前菌液与饲料充分混合，并使菌液全部吸附在饲料上。投饲3 h后使用虹吸器吸除水体中的杂质，最后向养殖箱中添加新水至水深5 cm。饲喂前，测定水质指标。

连续饲喂7 d，每天观察和记录附肢是否完整，计算死亡率和残肢率；养殖结束后对每个处理的克氏原螯虾称重，计算平均体重、体重增长率和饲料系数。

水质指标测定。水质指标测定使用快速水质分析盒(由湛江市浩洋生物科技有限公司生产)，参照试剂盒说明书进行测定。

生长指标测定。每天09：00记录各处理克氏原螯虾幼虾的死亡数量和出现残肢的虾数量，计算每天的死亡率和残肢率。试验结束后，计算体重增长率。死亡率、残肢率和体重增长率的计算公式如下：

体重增长率=[(-)]×100

(1)

死亡率=×100

(2)

残肢率=×100

(3)

饲料系数=(-)×100

(4)

式中，为始重，为末重，为饲料消耗量，为24 h内每个处理死亡数，为24 h内每个处理内出现附肢缺失的虾尾数，为每个处理投放克氏原螯虾的尾数。

数据统计与分析。试验数据使用Origin 2018软件进行单因素方差分析与绘图。

2 结果与分析

所测水质指标都在安全范围内，氯含量为0.010～0.015 mg/L，亚硝酸盐含量为0.005～0.010 mg/L，氨氮含量为0.1～0.2 mg/L，pH为7.9～8.0，溶解氧含量为7 mg/L。

解淀粉芽孢杆菌SS-42对克氏原螯虾死亡率的影响。由表1可知，对照组(CK)克氏原螯虾7 d总死亡率为50.00%，A、A、A组7 d总死亡率均为50.00%。由此可见，SS-42各饲喂量处理组与对照组相比无显著差异(>0.05)。

表1 解淀粉芽孢杆菌对克氏原螯虾死亡率的影响Table 1 Effects of B.amyloliquefaciens on the mortality rate of P.clarkii

解淀粉芽孢杆菌SS-42对克氏原螯虾残肢率的影响。由表2可知，克氏原螯虾出现残肢的情况主要出现在试验前中期，对照组(CK)7 d总残肢率为30.00%，A、A、A组7 d总残肢率均为30.00%。由此可见，不同饲喂量的SS-42菌株对克氏原螯虾幼虾总残肢率无显著影响(>0.05)。

表2 解淀粉芽孢杆菌对克氏原螯虾残肢率的影响Table 2 Effects of B.amyloliquefaciens on the stump rate of P.clarkii

解淀粉芽孢杆菌SS-42对克氏原螯虾体重增长率和饲料系数的影响。如表3所示，与对照组(CK)相比，各饲喂量SS-42处理组克氏原螯虾的体重增长率均显著提高(<0.05)，对照组(CK)的体重增长率为(17.14±1.06)%，A、A、A组体重增长率分别为(24.13±0.67)%、(29.44±1.26)%和(24.11±0.98)%。由此可见，当饲喂量为10CFU/(尾·d)克氏原螯虾的体重增长率最高。由表3可知，与对照组(CK)相比，A、A、A组饲料系数显著降低(<0.05)，说明添加解淀粉芽孢杆菌SS-42后饲料转化率显著提高(<0.05)。

地衣芽孢杆菌10-2对克氏原螯虾死亡率的影响。由表4可知，对照组(CK)克氏原螯虾7 d总死亡率为50.00%，B、B、B组7 d总死亡率均为50.00%。由此可见，地衣芽孢杆菌10-2各饲喂量处理组原克氏原螯虾7 d总死亡率与对照组相比无显著差异(>0.05)。

表3 解淀粉芽孢杆菌对克氏原螯虾体重增长率和饲料系数的影响Table 3 Effects of B.amyloliquefaciens on the body weight growth rate and feed coefficient of P.clarkii

地衣芽孢杆菌10-2对克氏原螯虾残肢率的影响。由表5可知，对照组(CK)克氏原螯虾7 d总残肢率为20.00%，B、B、B组7 d总残肢率均为20.00%。由此可见，不同饲喂量的10-2菌株对克氏原螯虾幼虾总残肢率无显著影响(>0.05)。

表4 地衣芽孢杆菌对克氏原螯虾死亡率的影响Table 4 Effects of B.licheniformis on the mortality rate of P.clarkii

表5 地衣芽孢杆菌对克氏原螯虾残肢率的影响Table 5 Effects of B.licheniformis on the stump rate of P.clarkii

地衣芽孢杆菌10-2对克氏原螯虾体重增长率和饲料系数的影响。由表6可知，对照组(CK)克氏原螯虾的体重增长率为(17.14±1.06)%，B、B、B组克氏原螯虾的体重增长率分别为(22.13±0.67)%、(21.44±0.83)%和(20.31±0.98)%。由此可见，与对照组(CK)相比，各饲喂量地衣芽孢杆菌10-2处理组克氏原螯虾的体重增长率显著提高(<0.05)，但B、B、B组间无显著差异(>0.05)。由表6可知，与对照组(CK)相比，B、B、B组饲料系数显著降低(<0.05)，说明添加地衣芽孢杆菌10-2后饲料转化率显著提高(<0.05)。

如图1所示，相同饲喂量下，2种菌株对克氏原螯虾幼虾的体重增长率有显著影响(<0.05)。不同饲喂量解淀粉芽孢杆菌SS-42处理组克氏原螯虾的体重增长率差异显著(<0.05)，当SS-42饲喂量为10CFU/(尾·d)时克氏原螯虾的体重增长率最高；不同饲喂量地衣芽孢杆菌10-2处理组克氏原螯虾的体重增长率无显著差异(>0.05)。

表6 地衣芽孢杆菌对克氏原螯虾体重增长率和饲料系数的影响Table 6 Effects of B.licheniformis on the body weight growth rate and feed coefficient of P.clarkii

图1 相同饲喂量的2种芽孢杆菌对克氏原螯虾体重增长率的影响Fig.1 Effects of two species of Bacillus at the same feeding amount on the body weight growth rate of P.clarkii

3 讨论

芽孢杆菌能够分泌高活性的胞外酶系，可将水体中的有机残余物迅速降解为无机物，有效促进养殖水体生态的良性循环。研究表明，复合型芽孢杆菌制剂对虾育苗时期氨氮和亚硝态氮的含量有显著影响，但解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对虾育苗水质的影响不明显。该试验中投放芽孢杆菌的方式是将芽孢杆菌混合饲料一起饲喂幼虾，3 h后使用虹吸式吸水器吸去残留粪便和饲料。

益生菌能够促进养殖动物生长，能抑制病原生长、补充营养、促进消化和提高免疫力，但不同菌种甚至同种不同菌株的作用方式各有侧重，效果也有所差异。关于芽孢杆菌制剂应用于对虾育苗、抗逆性的研究已有少量报道。研究表明，在对虾育苗体系中连续投入较高密度的芽孢杆菌可以显著提高幼体或仔虾的存活率，促进生长或变态，增强虾苗抗逆性。李高俊等研究表明进一步提高用菌量时作用效果并不会继续提升，甚至可能造成幼体存活率下降。该试验结果表明解淀粉芽孢杆菌SS-42菌株和地衣芽孢杆菌10-2菌株对克氏原螯虾幼虾死亡率和残肢率的影响不显著(>0.05)。试验期间幼虾无明显病原感染，水质良好，幼虾营养也较为充分，可能是因为试验周期过短，样本数较小，数据未体现出差异显著性。因此，在无明显胁迫条件下，与对照组相比，2种芽孢杆菌的作用效果难以通过存活率和残肢率体现出来。当饲喂量相同时，解淀粉芽孢杆菌SS-42处理组克氏原螯虾的体重增长率显著高于地衣芽孢杆菌10-2处理组，这可能是因为2种芽孢杆菌菌种或发酵后菌体以外的其他成分存在差异，作用效果明显不同。

4 结论

该试验用不同浓度的解淀粉芽孢杆菌SS-42和地衣芽孢杆菌10-2饲喂克氏原螯虾幼虾，通过测定生长状况分析2种菌株对克氏原螯虾幼虾生长的影响。结果表明，2种芽孢杆菌处理组克氏原螯虾的死亡率和残肢率与对照组相比差异不显著(>0.05)，平均体重增长率显著提高(<0.05)；当饲喂量相同时，饲喂解淀粉芽孢杆菌SS-42菌株处理组克氏原螯虾的平均体重增长率显著高于饲喂地衣芽孢杆菌10-2菌株的处理组(<0.05)；解淀粉芽孢杆菌SS-42饲喂量为10CFU/(尾·d)时各项生长指标表现最佳。