壮药白桐树多酚提取工艺优化

姜 晓， 王志尧， 王 韬， 马艳妮， 常 霞， 王卓雅

（1.郑州云德生物技术有限公司，郑州 450002； 2.河南省纳普生物技术有限公司，郑州 450002）

白桐树Claxylon indicum（Reinw.ex BL）Hassk在壮医药书籍和方剂中的药名为“美巧怀”，《广西民族药简编》《壮族民间用药选编》《广西壮族自治区壮药质量标准》等有书籍中均记载白桐树能“祛风毒，除湿毒，散瘀肿，调龙路，通水道，调谷道，用于发旺（痹证）”. 另外，《生草药性备要》《本草求原》《全国中草药汇编》《中药大辞典》、1977年版《中国药典》一部、《中华本草》《中药制剂汇编》、广州部队编《常用中药手册》等中医药书籍均记载白桐树有“祛风除湿、散瘀止痛”之效，可用于类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的防治［1-5］.但目前对于白桐树的研究多数集中于解热镇痛、抑菌作用、抗肿瘤、抗氧化等生物活性，而有关白桐树在抗RA方面研究鲜见报道. 作者前期研究发现白桐树酚类成分明显可改善CIA模型小鼠的各种体征.

白桐树属植物含酚类、生物碱、二萜、三萜、皂苷等化学成分［7-10］，其中酚类（主要是木脂素、新木脂素、香豆素）是该属植物主要成分［11］，也是有效成分，具有抗炎、调节免疫等多种活性. 目前，关于白酮树酚类成分的研究较少，并未有明确的方法来提取白桐树的酚类成分，这制约了常用民族药白桐树更广泛的临床应用.因此，研究开发一种简便快捷的白桐树酚类化合物提取分离方法，对于深入研究白桐树酚类成分抗RA作用的物质基础以及充分开发和利用壮药白桐树资源具有重要意义.

没食子酸是一种常见多酚类物质，以没食子酸为代表的多酚类化合物在碱性溶液中可将钨钼酸还原成蓝色化合物，该类成分在760 nm 左右处有最大吸收，且吸收值与多酚化合物含量成正比，因此可以没食子酸为标准物质，利用标准曲线法定量多酚类成分的总含量［12-15］. 因此，本课题以多酚含量为指标，对照品为没食子酸，采用Folin-Ciocalteu 比色法测定白桐树中的多酚含量，再通过提取时间、提取次数及溶剂体积进行单因素实验，最后再通过响应面法优化提取工艺.

1 材料与方法

1.1 仪器

T9紫外可见分光光度计；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；生物安全柜（Thermo Scientific）；进口二氧化碳培养箱NBS Galaxy170s（Eppendorf）；离心机（Cence湘仪TDZ5-WS）；酶标仪（Bio-rad，型号Imark）.

1.2 材料试剂

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究所，批号110831-201605）；福林酚（北京索莱宝科技有限公司，批号921P037）；无水碳酸钠（国产分析纯）；甲醇（天津市致远化学试剂有限公司，批号2021年030113）；乙醇（天津市致远化学试剂有限公司，批号2020年112040）；白桐树药材购自河南禹州四季青药材行.

1.3 标准曲线的测定

精密称量没食子酸对照品10.86 mg，并加入适量蒸馏水定容至100 mL，得到质量浓度为0.108 mg/mL的标准溶液.

分别吸取标准溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL容量瓶中，再量取6 mL蒸馏水，摇匀后用移液枪吸取0.5 mL福林酚试剂，摇匀并等待1 min，再用移液枪吸取1.5 mL的碳酸钠溶液（75 g/L），混匀后用蒸馏水定容至刻度线. 在75 ℃下加热10 min，待冷却后在760 nm 下测定吸光度，得到回归方程Abs=0.998 7×c+0.026 42（R2=0.998 7）.

1.4 方法学验证

1.4.1 稳定性实验

称量样品0.2 g至锥形瓶中，加入25 mL的蒸馏水超声30 min，共提取3次，将滤液用旋转蒸发仪浓缩至50 mL以下，用蒸馏水定容至50 mL. 各吸取1～10 mL容量瓶中，再加入6 mL水，0.5 mL福林酚试剂混匀，1 min后加入1.5 mL碳酸钠试剂（75 g/L）混匀后定容，在75 ℃下加热10 min冷却后在760 nm 下测量0、2、4、6 h后吸光度. RSD=1.56%，所以样品的稳定性较好.

1.4.2 精密度实验

按照1.4.1步骤制作样品溶液，重复测定六次吸光度，在760 nm下测定吸光度，RSD=0.02%，表明精密度较优.

1.4.3 重复性实验

按照1.4.1步骤制作六份供试品溶液，在760 nm下测定吸光度，RSD=4.07%，表明重复性较好.

1.4.4 加样回收率实验

按照1.4.1 步骤制作一份供试品溶液，量取9 份1 mL 的供试品溶液到10 mL 的容量瓶中，加入0.1、0.2、0.3 mL 的没食子酸对照品溶液，然后再依次加入6 mL水、0.5 mL福林酚混匀，1 min后吸取1.5 mL 碳酸钠溶液（75 g/L）到容量瓶中，混匀后在75 ℃下加热10 min，待冷却后在760 nm下测吸光度. 加样回收率平均值为98.10%，RSD=1.72%.

1.5 单因素影响实验与响应面法

分别以溶剂体积、超声时间和提取次数为单因素影响实验变量，根据提取多酚含量（质量比，单位μg/g），选出最适宜的参数，根据得出参数设置响应面法优化工艺的变量和水平，具体实验情况见下文.

2 结果与分析

2.1 单因素影响实验结果

2.1.1 溶剂体积的筛选

称取0.2 g药材，分别加入10、25、50、100、150 mL 的蒸馏水，提取两次，将提取所得的滤液混合，然后浓缩至50 mL 以下，再用蒸馏水定容至50 mL容量瓶中. 各吸取1～10 mL 容量瓶中，再量取6 mL 水放入内，然后用移液枪吸取0.5 mL的福林酚试剂混匀，1 min 后用移液枪加入1.5 mL 碳酸钠试剂（75 g/L）混匀后定容，在75 ℃下加热10 min，冷却后在760 nm 下测吸光度. 结果如图1，可知溶剂体积在100 mL下多酚含量（723.19 μg/g）最大.

图1 溶剂体积对提取物中多酚含量的影响Fig.1 Effect of solvent volume on polyphenol content in extract

2.1.2 提取次数的筛选

称取0.2 g药材，加入25 mL蒸馏水，分别提取1、2、3、4、5次，滤液定容至50 mL容量瓶，按照2.1.1的方法测吸光度. 结果如图2，提取4次时多酚含量820.9 μg/g最大.

图2 提取次数对提取物中多酚含量的影响Fig.2 Effect of extraction times on polyphenol content in extract

2.1.3 超声时间的筛选

称取0.2 g 药材，加入25 mL 蒸馏水，提取2 次，超声时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h. 滤液混匀后定容至50 mL容量瓶，按照2.1.1的方法测吸光度，结果如图3，超声时间2 h多酚含量（735.29 μg/g）最大.

图3 超声时间对提取物中多酚含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on polyphenol content in extract

2.2 响应面法优化工艺

从单因素影响实验的结论中得到最优的溶剂体积为100 mL左右，超声时间为2 h左右，提取次数为4 次左右，为了进一步优化提取工艺参数将采用响应面法.

三个自变量为：A（溶剂体积）、B（超声时间）、C（提取次数）；响应值为多酚含量；设置三水平因素，如表1所示，然后根据这三个变量和三个水平进行响应面法实验设计.

表1 白桐树多酚提取工艺优化实验水平与因素Tab.1 Experimental levels and factors of polyphenol extraction process optimization of Claxylon indicum

2.2.1 模型方差分析

采用响应面法进一步优化提取工艺参数，白桐树多酚提取实验结果见表2.

表2 白桐树多酚提取工艺优化实验结果Tab.2 Results of optimization of polyphenol extraction process of Claxylon indicum

使用Design expert.7.0软件可得到三因素的方程模型：

式中：E为多酚含量；A为溶剂体积；B为超声时间；C为提取次数.

由下表3方差分析表可知P＜0.000 1，该模型显著，R2为0.997 5；由F值可知，三个因素A、B、C对于多酚含量的影响大小顺序为B（超声时间）＞A（溶剂体积）＞C（提取次数），A2、B2、C2、AB、AC、BC交互影响极为显著，因此，提取工艺的参数对多酚含量的影响较大.

表3 方差分析表Tab.3 ANOVA of regression analysis

2.2.2 响应面分析

三因素A（溶剂体积）、B（超声时间）、C（提取次数）交互影响如图4～图6. 由图4（a）、图5（a）、图6（a）的等高线图可知当A（溶剂体积）、B（超声时间）、C（提取次数）取值较小时等高线密度较大，而当取值较大时等高线密度小，因此在三因素取值较小时对多酚含量的影响较为显著，而当取值较大时对多酚含量的影响较小；由图4（b）、图5（b）、图6（b）的响应面可知，当三因素取值较小时他们的曲线较陡，而当取值较大时曲线较为平缓，因此证明当取值较小时对多酚含量的影响较大，而取值较大时对多酚含量的影响较小，与等高线图分析结果一致.

图4 E=f（A，B）的响应面及等高线图Fig.4 Response surface plot and contour plot of E=f（A，B）

图5 E=f（A，C）响应面及等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot of E=f（A，C）

图6 E=f（B，C）响应面及等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plot of E=f（B，C）

经过该实验，测得最优的工艺提取参数为：溶剂体积81.59 mL、超声时间2.07 h，提取次数4.29 次，这样的参数下得到的多酚含量最好，而在单因素影响实验中预测参数：溶剂体积100 mL、超声时间2 h、提取次数4次与最终的理论值恰好符合，证明该实验结果与预测值有很好的拟合性，在该提取工艺的参数下可以获得较优的多酚含量值.

3 结论

本研究以多酚含量为指标，对照品为没食子酸，采用Folin-Ciocalteu 比色法测定白桐树中的多酚含量，再通过提取时间、提取次数及溶剂体积进行单因素实验，最后再通过响应面法优化，得到最佳的提取工艺为：样品的溶剂为水，提取时间为2 h，提取次数为5次，溶剂体积为150 mL. 优化的提取工艺操作简单、重复性好，对于壮药白桐树多酚的有效提取具有一定的参考价值.