共代谢条件下荧蒽降解菌的差异蛋白质组学分析

钟 琦,王红旗,姜茹菡,肖雅倩,吴枭雄

共代谢条件下荧蒽降解菌的差异蛋白质组学分析

钟 琦,王红旗*,姜茹菡,肖雅倩,吴枭雄

(北京师范大学水科学研究院,北京 100875)

以课题组筛选出的多环芳烃高效降解菌--蜡样芽孢杆菌()DQ01菌株为研究对象,以荧蒽为目标污染物,以牛肉膏蛋白胨培养基(LB培养基)为共代谢基质,基于同位素相对和绝对定量技术(iTRAQ)比较细菌在无机盐培养基(MSM培养基)和MSM-LB培养环境中降解荧蒽的全蛋白表达水平,旨在揭示蜡样芽孢杆菌在共代谢过程中分子代谢水平上的变化.结果共检测到64个差异表达蛋白质,其中上调表达的蛋白质有28个,下调表达的蛋白质36个.鉴定到差异蛋白的功能集中在代谢、应激反应、信息传递和调控等方面,同时对比KEGG通路富集分析的结果,也显示细菌有关能量代谢和信息传递、调控的通路产生的变化.比较细菌在是否处于共代谢下的差异蛋白表达,推测细菌在降解多环芳烃过程中的关键环节是小分子代谢和适应外界环境的通路.

共代谢；差异蛋白质组学；多环芳烃；微生物降解；蛋白质功能分析

多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上的苯环连在一起组成的一类有机化合物[1],广泛存在于土壤、水体和大气中.它们通常是由化石燃料和其他有机物质的不完全燃烧形成的[2],具有“三致”效应(致癌、致畸、致突变),被视作典型的持久性有机污染物[3].PAHs具有强疏水性,容易与土壤沉积物中的有机质结合,与许多其他有机污染物相比难以降解[4].对于环境中的PAHs污染,常用的降解手段包括物理、化学和生物法[5],其中,生物法因具有无二次污染和经济效益高等优点而受到广泛关注[3].根据目前研究报道,包括假单胞菌属()[6]、红球菌属()[7]和芽孢杆菌属()[8]等在内的微生物已被证明具有良好的PAHs降解能力.

差异蛋白质组学,是研究两个或多个样本在不同状态或不同培养条件下的蛋白质组变化,以分析重要生命过程,找出关键的不同蛋白质,作为定性和功能分析的标志物[9].可以通过分析细菌在降解PAHs过程的蛋白质组学结果,推测其降解途径,有助于认识细菌降解PAHs的机理.Mukherjee等[10]通过对铜绿假单胞菌() ASP-53菌株降解芘的过程中蛋白质组学分析发现,有关蛋白质折叠(分子伴侣)、应激反应等功能的蛋白质表达上调,并鉴定出该细菌遵循水杨酸途径降解芘.Yun等[11]研究了新鞘脂菌属(sp.) US6-1菌株在降解PAHs时的蛋白质组学,发现该细菌通过外二醇裂解途径引导菲的代谢途径.同时微生物降解PAHs的难易程度取决于其化学结构的复杂性和降解酶的适应程度[12].低环的PAHs(2～3环)能够被微生物以PAHs作为唯一碳源的方式有效的去除和修复[13],而四环或四环以上的PAHs一般以共代谢的方式被细菌降解[14].1963年Jensen[15]在共氧化[16]的基础上提出了共代谢(co-metabolism)的概念,即在有其他碳源和能源存在的情况下,微生物能够增强酶的活性,提高非生长基质的降解效率.前人的研究表明在加入共代谢基质的情况下能够提高细菌降解非生长基质PAHs的效率,并且有可能产生新的降解机制与途径.Rentz等[17]研究用水杨酸和琥珀酸作为鞘氨醇单胞菌JAR02菌株(sp.)降解苯并[a]芘的共代谢基质,使得苯并[a]芘的降解率有所提高,并用HPLC/MS联用技术进行分析,发现能检测出两种新的中间产物.Juhasz[18]的研究指出在PAHs的混合体系中,低分子量PAHs的存在改善了五环和七环PAHs化合物的降解效果,混合体系中的苯并[a]芘和六苯并苯相对于它们作为唯一碳源的情况下,降解效率都有所提高.Wang等[19]发现一种假黄单胞菌属细菌(sp.)可以在20mg/L的葡萄糖存在下在72h时降解超过95%的50mg/L的DDT.同时,氮源的存在可能对共代谢过程也有着影响.Chaudhary等[20]分离出一株链霉菌属(),在添加0.1%酵母提取物作为共底物的培养基中,对芴、菲进行了降解行为研究,发现在100 μg/g的浓度下,该菌株在15d内降解率可达92%和80%.Zhao等[21]的研究指出牛肉膏蛋白胨-无机盐培养基和玉米淀粉分别配制葡萄糖、甘油、尿素、氯化铵、蛋白胨等不同浓度的混合物可以作为降解实验的共代谢基质,并且发现氮源对地衣芽孢杆菌B-1共代谢高效氯氰菊酯也有着促进作用[22].目前国内外的研究主要集中在共代谢条件下细菌对于复杂污染物降解效率的改变以及不同的因素(例如温度和pH值等)对于微生物共代谢复杂污染物的影响[23-25]等.对于应用蛋白质组学分析细菌共代谢PAHs机制的研究还有待进一步发展.

为了科学地指导微生物在降解PAHs方面的应用,提高微生物对PAHs的降解效率,了解细菌在共代谢过程中分子生物学水平上的变化,本研究以课题组筛选出的PAHs高效降解菌--蜡样芽孢杆菌()DQ01菌株为研究对象,以荧蒽为目标污染物,设置以LB培养基为共代谢基质的实验条件,比较细菌在LB+荧蒽和细菌将荧蒽作为唯一碳源条件下的差异蛋白表达结果,可以推断出细菌在降解多环芳烃过程中的控速环节.研究揭示了在一种新的共代谢条件下细菌的共代谢机制,运用蛋白质组学的分析方法研究细菌提升PAHs的降解效率的机制,为细菌更好地应用于PAHs污染降解提供了参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料与培养基、溶液

主要药品来源:荧蒽(分析纯,美国J.T.Baker公司);丙酮(色谱纯,美国J.T.Baker公司);乙腈,正己烷(色谱纯,美国MREDE公司);NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、NaNO3等(分析纯,天津福晨化学试剂有限公司);蛋白胨、酵母粉(分析纯,北京奥博星生物有限责任公司).

无机盐培养基(MSM培养基)和牛肉膏蛋白胨培养基(LB培养基)的配制方法参考许洁等[26]的研究成果.

荧蒽储备液:称取荧蒽100mg,在棕色容量瓶中用丙酮定容至100mL,此时荧蒽浓度为1000mg/L,转移到蓝盖瓶内,缠上封口膜之后在通风橱内保存.

以课题组前期从天津石油污染地区筛选得到的PAHs高效降解菌株--蜡样芽孢杆菌()DQ01菌株为研究靶细菌.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养 将前期纯化培养的蜡样芽孢杆菌的单克隆菌落放入高温高压灭菌后冷却至常温的LB 培养基中培养,培养箱的设置为温度30℃,转速110r/min,24h后蜡样芽孢杆菌达到对数期.

1.2.2 实验设置 配置实验组MSM培养基,加入1g/L荧蒽储备液,使MSM中荧蒽终浓度为100mg/L,盖上封口膜之后在通风橱中静置过夜,使丙酮挥发完全.

在MSM培养基、荧蒽-MSM和荧蒽-MSM+LB体系中加入倒掉培养基后经PBS缓冲液洗涤3次的蜡样芽孢杆菌,控制初始OD600值为0.4左右,放入温度30℃,转速110r/min的培养箱中培养24h.以上所有操作均进行3次平行重复.

荧蒽-MSM体系是在20mL的MSM溶液中加入2μL的荧蒽储备液,荧蒽-MSM+LB体系是在15mL的MSM溶液中加入5mL的LB培养基和2μL的荧蒽储备液.

1.2.3 非靶向蛋白组学分析 蛋白提取、肽段酶解和iTRAQ标记:将在MSM培养基、荧蒽-MSM 和荧蒽-MSM+LB体系中培养了24h的蜡样芽孢杆菌离心后倾倒培养基,用PBS缓冲液洗涤3次,第1个作为后续的对照组菌体样品,后2个作为后续的实验组菌体样品.每个样品都进行3组的平行操作.

样品采用SDT裂解法提取蛋白质;采用BCA 法进行蛋白质定量;每份样品取适量蛋白质采用超滤管辅助样本制备的(FASP)方法进行胰蛋白酶酶解[27];然后用C18纯化柱对酶解肽段进行脱盐,用40μL Dissolution buffer对冻干的肽段复溶,用OD280的值对肽段定量.接着分别取各样品100μg肽段,按照AB SCIEX公司同位素相对和绝对定量技术(iTRAQ)标记试剂盒说明书进行标记.

SCX色谱分级:进行初步分离,以降低每个组分中肽段样品的复杂程度.将每组标记后的肽段混合,采用AKTA Purifier 100进行分级.缓冲液A液为10mmol/L KH2PO4, 25% CAN, pH值 3.0, B液为10mmol/L KH2PO4, 500mmol/L KCl, 25%CAN, pH值3.0.色谱柱以A液平衡,样品由进样器上样到色谱柱进行分离,流速为1mL/min.洗脱过程中监测214nm的吸光度值,每隔1min需要收集洗脱组分,分别冻干后采用C18纯化柱脱盐.

样品液相采集:每份分级样品采用纳升流速的HPLC液相系统Easy nLC进行分离.缓冲液A液为体积浓度0.1%的甲酸水溶液,B液为体积浓度0.1%的甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%).色谱柱以95%的A液平衡,样品由自动进样器上样(上样柱,Thermo Scientific公司Acclaim PepMap100, 100μm×2cm, nanoViper C18),经过分析柱(Thermo Scientific公司 EASY column, 10cm, ID75μm, 3μm, C18-A2)分离,流速为300nL/min.

样品质谱检测:样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析.母离子扫描范围为300～1800/,一级质谱分辨率为70000at 200/, AGC target 为1×106, Maximum IT为50ms,动态排除时间为60.0s.每次全扫描后采集20个碎片图谱.

蛋白质分析:用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4对质谱分析原始数据进行查库鉴定及定量分析.一级离子质量容差为±0.002%;二级离子质量容差为0.1Da;可信肽段筛选标准为£0.01.蛋白质比率按蛋白质唯一的多肽的中位数计算,根据蛋白质定量值的中位数进行数据矫正.分别利用Blast2GO和KAAS软件对检测到的蛋白进行GO注释和KEGG注释.

2 结果与分析

2.1 差异表达蛋白鉴定结果

按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且<0.05的标准筛选差异表达蛋白质,MSM-LB vs MSM组的上调差异表达蛋白质有28个,下调差异表达蛋白质36个,共有64个.

针对蜡样芽孢杆菌在MSM-LB和MSM实验组降解荧蒽过程中相比表达显著差异的蛋白进行详细分析(表1).

表1 表达倍数变化大于1.2倍的差异蛋白的详细情况

续表1

续表1

注:差异倍数表示蜡样芽孢杆菌在MSM-LB和MSM实验组中差异表达蛋白的倍数之比,大于1表示上调,小于1表示下调;value表示假设检验的值;蛋白功能是根据鉴定结果与NCBI数据库比对而来;功能描述是根据数据库注释或文献报道得出.

咪唑甘油磷酸合成酶、核黄素ECF转运蛋白、UDP-葡萄糖基转移酶、PTS纤维二糖转运蛋白和ABC转运蛋白渗透酶都显示出了非常显著的上调表达,说明这些蛋白在细菌的共代谢行为中可能都起到了至关重要的作用;而L-乳酸脱氢酶3、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酸转移酶、乙醇活性脱氢酶/乙醛活性还原酶均显示出了下调表达的趋势,这些蛋白在蜡样芽孢杆菌以荧蒽为唯一碳源时更加活跃.

2.2 差异表达蛋白的GO功能分析

表2 差异蛋白的GO功能分析

基因本体论GO(Gene Ontology)是一个标准化的功能分类体系,提供动态更新的标准化词汇表,并以生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)3个方面描述生物体中基因和基因产物的属性[39].使用GO数据库对检测到的差异蛋白进行功能注释分析,按照与GO功能分类相关的差异表达蛋白质数目排序,分析结果如表2所示.

根据GO功能注释结果,按照生物过程、分子功能和细胞组分3个方面进行划分.检测到差异蛋白数量最多的生物过程是代谢过程,其次细胞过程、细胞代谢过程和有机物代谢过程也存在着15个以上的差异蛋白质.检测到的差异蛋白数量最多的分子功能是催化活性,紧接其后的是转移酶活性、结合和氧化还原酶活性.细胞组分分类中,被检测到的差异蛋白数最多的是组成细胞相关的蛋白,膜、膜部分和细胞部分等组分也都有着不少的差异蛋白存在.GO功能注释为后续的蛋白具体功能分析提供了思路.

2.3 差异表达蛋白的KEGG通路分析

图1 差异蛋白KEGG通路分析TOP 20

横坐标表示显著富集的KEGG通路;纵坐标表示每条KEGG通路中包含的差异表达蛋白质数目

在生物体中,需要不同蛋白质相互协调才能完成一系列生化反应以行使其生物学功能.因此,通路分析能更系统、全面地了解细胞的生物学过程、性状.KEGG是常用于通路研究的数据库之一,它是由海量文献中的信息整合而来,以图形语言描述众多的代谢途径以及各途径之间的相互关系,收录了新陈代谢、细胞过程等多个方面的通路信息[40].通过对显著性差异表达的蛋白质进行KEGG通路注释,能够了解这些蛋白可能参与的代谢或信号通路.对MSM-LB vs MSM的差异表达蛋白质进行KEGG通路富集分析,如图1所示.丙酮酸代谢中检测到的差异蛋白数量最多,为4个;糖酵解/糖异生、丙酸代谢、丁酸代谢、双组分系统等通路次之.

3 讨论

通过对差异蛋白功能分析,发现在共代谢基质存在的情况下,细菌与能量代谢、应激反应以及信息传递、调控相关的蛋白都有上调表达的现象.推测通过这些蛋白的高表达,使得细菌在降解荧蒽的过程中能够有特别的能量代谢途径和信息传递与调控方式,更快适应不良的碳源环境,从而能够高效降解荧蒽.同时参与丙酮酸降解、丙酸降解、糖酵解通路、双组分系统和趋化性的数个蛋白都有下调表达的趋势,推测这些通路只在蜡样芽孢杆菌以荧蒽为唯一碳源时才得到更多的利用,是细菌以荧蒽为唯一碳源代谢时的关键途径.

3.1 与代谢有关的差异蛋白

综合分析64个差异表达的蛋白,其中有16个蛋白与代谢过程相关.其中涉及到数个过程,如:能量的产生、糖类的转运与代谢、维生素和微量元素的转运、氨基酸的转运、无机离子的转运、丙酮酸代谢、糖酵解等等.而细菌的代谢方式与是否处于共代谢环境下也有着关系.

咪唑甘油磷酸合成酶是由HisH(23kDa)和 HisF(28kDa)组成.HisH提供谷氨酰胺转氨酶活性,产生HisF合成咪唑甘油磷酸(IGP)和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖(AICAR)所必需的氨.Liu等[33]指出咪唑甘油磷酸合成酶参与组氨酸生物合成和细胞氮化合物代谢,为葡萄糖/脂肪酸合成提供碳框架,为细胞生命活动和GY2B菌株降解菲提供能量,这说明唑甘油磷酸合成酶在细胞的能量代谢等方面起着重要的作用.CitMHS家族转运蛋白是细菌中负责金属-柠檬酸盐络合物转运的二级转运体[37].有学者认为某些细菌利用金属-柠檬酸盐络合物作为柠檬酸和金属的来源[41].柠檬酸是一种弱有机酸,可以作为能量中间体和碳源[42],它是细胞三羧酸循环的中间产物,在能量代谢中起重要作用[43].磷酸转移酶系统(PTS)是细菌摄取己糖、己糖醇、二糖等糖类物质的主要机制,它介导碳水化合物的摄取和磷酸化并控制代谢[44].磷酸转移酶系统(PTS)能够特异性地结合某一种或几种糖类,使相应的糖类发生磷酸化,促进糖的进一步分解代谢[45].Houot等[46]的研究发现霍乱弧菌在LB培养基中能表达两个额外的基于PTS的生物膜调节途径,但在只添加0.5%(/)的葡萄糖或丙酮酸的最低培养基中却不能表达.本研究的结果与这一发现有着一定的吻合性,推测在设置的共代谢条件下,细胞因外部培养环境的改变而提升了PTS纤维二糖转运蛋白亚基IIC的表达水平,而这有利于细胞对于糖类的运输.3-羟基-5-膦酰氧基戊烷-2,4-二酮硫解酶其调控基因为LsrF,参与群体感应信号自动诱导剂-2 (AI-2)的调控,能够催化乙酰基从P-HPD转移到辅酶A,形成二羟基丙酮磷酸和乙酰辅酶A[34].乙酰辅酶A是代谢的重要中间产物,直接参与细胞内三羧酸循环在内的重要生命过程,可以释放出能量用以ATP的合成[47].以上蛋白的高表达均指向细菌的能量代谢水平增加,推测是因为LB培养基中的碳源更容易被细菌所利用,因此造成了能量代谢水平增长的现象,进而提高对于荧蒽的降解能力.

ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)又被称为ABC transporter,在原核及真核生物中都广泛分布的一类超家族膜整合蛋白,能够催化并利用ATP水解所产生的能量实现底物跨膜转运[32].ABC转运蛋白渗透酶是细胞质转运系统[48].氨基酸ABC转运蛋白通透酶和蛋氨酸ABC转运渗透酶都属于氨基酸转运系统的膜组分,其中如果缺乏蛋氨酸,就会导致体内的蛋白质合成受阻[49].能量耦合因子型(ECF)转运蛋白是一类新的ABC(ATP- binding cassette)转运蛋白,在原核生物中负责维生素和微量元素的跨膜转运[29].核黄素又被称为维生素B2,该物质是多种酶反应所需要的辅助因子前体[50],因此核黄素ECF转运蛋白在细胞的多种酶反应中也都发挥着重要的作用,这些反应可能直接或者间接的影响到了蜡样芽孢杆菌降解荧蒽的行为.这些高表达的蛋白都是涉及到细菌的跨膜转运功能,Buesen等[51]的研究指出ABC转运蛋白可能与苯并[a]芘的跨膜转运有关;孔德康等[52]也发现红球菌BAP-1降解荧蒽时细胞膜上主要受影响的蛋白是与能量、转运相关的膜蛋白,ABC转运蛋白是BAP-1跨膜运输荧蒽的主要载体蛋白.因此在共代谢条件下,蜡样芽孢杆菌对于荧蒽的摄取与运输可能更为活跃,使得细菌降解荧蒽的能力提高.

L-乳酸脱氢酶3、乳糖基谷胱甘肽裂解酶、乙醇活性脱氢酶/乙醛活性还原酶等蛋白参与到了细菌的丙酮酸代谢途径之中,它们表现出的是下调的趋势.荧蒽的微生物降解途径通常始于荧蒽芳香环上C-1,2、2,3、7,8或8,9位的双加氧反应[53],在苯环裂解双加氧酶的作用下从而生成相对应的二氢二醇荧蒽,再经过一系列酶促反应逐步生成小分子芳香族化合物,如邻苯二酚、原儿茶酸等,通过后续糖酵解、丙酮酸代谢最终进入TCA循环[54].在共代谢基质存在的情况下,相对来说多环芳烃的降解通路的碳源利用效率较低,细菌可能会利用其它多条小分子代谢通路,但是在以荧蒽为唯一碳源的情况下,细菌对于降解荧蒽后续过程的小分子代谢可能主要利用丙酮酸代谢通路,造成丙酮酸代谢通路在蜡样芽孢杆菌以荧蒽为唯一碳源情况下十分活跃.

值得注意的是Qin等[55]使用葡萄糖作为微杆菌属(sp)M.CSW3菌株降解苯并[a]芘的共代谢基质,其蛋白质组学分析表明此种情况下抑制了糖代谢相关蛋白的表达.这与本研究得出的结果相悖,推测可能是由于共代谢基质的不同而造成的差异.这也可以作为今后相关研究的一个方向.

3.2 与应激反应有关的差异蛋白

综合分析64个差异表达的蛋白,其中有5个蛋白与应激反应相关.其中涉及到数个过程,如:应激反应产生膜蛋白和产生孢子外壳蛋白等.

GlsB/YeaQ/YmgE家族应激反应膜蛋白是一类存在于细胞膜上,因环境中的胁迫因素而应激表达的蛋白.目前有报道指出GlsB/YeaQ/YmgE家族蛋白在环境适应中出现高表达的情况.Li等[56]从青藏高原石油污染土壤中分离出枯草芽孢杆菌DM2,与枯草芽孢杆菌亚种相比,其全基因组测序中发现了一些菌株特异性蛋白基因编码,其中就有GlsB/ YeaQ/YmgE家族应激反应膜蛋白,这些特异性蛋白反映了该菌株对恶劣条件和碳氢化合物利用的进化适应性.Goyal等[57]找到了一种高度耐受丁醇的松鼠葡萄球菌KM16,它在丁醇的胁迫下也能表达出GlsB/YeaQ/YmgE家族应激反应膜蛋白,这可能与该细菌的丁醇耐受性相关.推测此蛋白可能是蜡样芽孢杆菌存在利用荧蒽这一不良碳源的情况,进而发生了应激的高表达情况,以此帮助细菌适应外部的生长环境.同时还有数个孢子外壳蛋白的高表达情况存在,孢子会在环境攻击的条件下产生在细菌中,营养缺乏通常就会启动孢子的形成[58].孢子外壳蛋白能使得细菌对各种不良环境具有极强的抵抗力,包括高温、干燥辐射和毒性物质等[35].Wang等[59]对于荧蒽诱/导的红球菌进行了比较蛋白质组学分析,发现孢子外壳蛋白在两个实验组中出现表达上调的情况,认为通过改变孢子外壳蛋白的表达水平,红球菌可以适应低碳环境并抵抗PAHs的毒性作用.Hong等[60]指出菌株HZ01在石油处理下,发生营养饥饿和环境胁迫,编码孢子外壳蛋白E的基因显著上调.因此推测孢子外壳的形成能帮助细菌应对以荧蒽为唯一碳源时的挑战.相比于以荧蒽为唯一碳源时,在共代谢基质存在的情况下,细菌对于外部培养环境中荧蒽的刺激会表现的更加明显,更多的表达出蛋白来适应碳源的变化.

3.3 与信息传递、调控有关的差异蛋白

综合分析64个差异表达的蛋白,其中有5个蛋白与信息传递、调控相关.其中涉及到数个过程,如:转录信息的传递与调控、群体感应过程的调控等.硝酸还原酶钼辅因子组装伴侣NarJ/NarW、反应调节受体蛋白以及双组分传感器蛋白都呈现出下调的趋势,它们参与过程主要涉及到细菌的双组分系统和趋化性.

双组分系统是原核生物和低等真核生物感知环境和内部信息并做出反应的相关蛋白质机制,使得细胞能够感知和处理信号[61].双组分系统调控了细菌生长繁殖、营养利用等多方面的过程,使得细菌能够在不同的环境甚至逆境中生存[62].詹清[63]的研究发现新鞘氨醇杆菌US6-1菌株中的双组分系统参与了降解苯并芘的调控过程.细菌趋化性是指细菌对有利环境的趋附行为和对有害环境的避离行为[64].Zaval'skii等[65]用光密度法和毛细管法研究发现两株恶臭假单胞菌菌株对萘都有正趋化作用.

分析鉴定结果可以发现荧蒽作为唯一碳源时,参与到蜡样芽孢杆菌双组分系统和趋化性通路中的蛋白表达量更高,而这些通路与荧蒽的降解也存在着紧密的联系,暗示了这些通路所发挥的作用可能对于蜡样芽孢杆菌降解荧蒽起着重要的调控作用,也许是细菌为了利用碳源和能源而进化出的优势选择.

4 结论

4.1 本研究比较了蜡样芽孢杆菌分别在MSM-LB和MSM培养基环境中降解荧蒽的全蛋白表达水平差异.以MSM-LB vs MSM变化1.2 倍以上(上调大于1.2 倍或者下调小于0.83 倍)且<0.05 的标准筛选差异表达蛋白质,共鉴定到64个差异表达蛋白质,其中上调表达的蛋白质有28个,下调表达的蛋白质36个.

4.2 差异蛋白的功能集中在代谢、应激反应、信息传递和调控等方面,同时对比KEGG富集分析的结果,也显示细菌有关能量代谢和信息传递、调控的通路产生的变化.

4.3 细菌在更容易利用LB中的碳源的情况下,将其作为生命能量来源的通路生理效率更高,相对来说多环芳烃降解通路产生能量的效率较低.比较细菌在LB+荧蒽和细菌将荧蒽作为唯一碳源下的差异蛋白表达,推测细菌在降解多环芳烃过程中的关键环节是丙酮酸代谢之类的小分子代谢通路和对外界环境作出反应的双组分系统和趋化性通路.因此进一步的研究可以着重于相关通路中蛋白对于蜡样芽孢杆菌降解荧蒽的控速作用.

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Differential proteomic analysis of fluoranthene-degrading bacteria under co-metabolic conditions.

ZHONG Qi, WANG Hong-qi*, JIANG Ru-han, XIAO Ya-qian, WU Xiao-xiong

(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)., 2022,42(9)：4423～4432

The research object was thesp. DQ01, a highly effective Polycyclic Aromatic Hydrocarbons degrading bacteria screened by the research group. Fluoranthene and Luria-Bertani medium (LB medium) were used as the target pollutant and the co-metabolic substrate, respectively. The whole protein expression result of bacteria degrading fluoranthene in Minimal Salt Medium (MSM) and MSM-LB culture environment was compared with the isobaric tags for relative and absolute quantity (iTRAQ) technology to reveal changes in molecular metabolism level ofin the process of co-metabolism. In the results, a total of 64 differentially expressed proteins were detected, consisting of 28 up-regulated proteins and 36 down-regulated proteins. It was identified that the functions of differential proteins focused on metabolism, stress response, information transmission and regulation. At the same time, compared to the results from KEGG pathway enrichment analysis, the changes in bacterial pathways were thought to relate to energy metabolism, information transmission and regulation. Compared with the differential protein expression of bacteria under co-metabolism, the key link of bacteria in the process of degrading PAHs could be speculated to be the pathway of small molecule metabolism and adaptation to the external environment.

co-metabolism；comparative proteomic；PAHs；microbial degradation；protein functional analysis

X172

A

1000-6923(2022)09-4423-10

2022-02-21

国家自然科学基金资助项目(41772234)

*责任作者, 教授, amba@bnu.edu.cn

钟 琦(1998-),男,安徽铜陵人,北京师范大学硕士研究生,主要从事污染土壤修复与治理研究.