基于可疑筛查技术研究有机磷阻燃剂V6转化规律

李建华,张亚运,孟维坤,苏冠勇

基于可疑筛查技术研究有机磷阻燃剂V6转化规律

李建华,张亚运,孟维坤,苏冠勇*

(南京理工大学环境与生物工程学院,江苏省化工污染控制与资源化重点实验室,江苏 南京 210094)

运用Orbitrap高分辨质谱仪,评估了人体肝微粒体(HLM)代谢V6的转化规律.除5种已被报道过的O-脱烷基、氧化性去磷酸化和氧化脱氯产物外,首次发现了6种新型产物.基于其MS/MS质谱图,该6种代谢产物被鉴定为醛基和羧基产物.其中,5种代谢物生成量随孵育时间呈线性增加趋势,具有累积性.此外,推导的代谢途径表明,脱烷基化和羟基化代谢物进一步转化为次级代谢物,即醛和羧基代谢物.

新型有机磷酸酯；人肝微粒体；高分辨质谱仪；体外代谢；生物转化规律

有机磷酸酯(OPEs)是一类以磷酸基团为基本骨架,其侧链被烷基、芳香基或卤烷基取代的酯类化合物.由于具有良好阻燃性能和增塑性能,OPEs目前是公认的替代性阻燃剂之一,其生产量和使用量大幅攀升[1-4].2,2-双(氯甲基)丙烷-1,3-二基四(2-氯乙基)二磷酸酯(V6)是一种新型氯代OPE,常与三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(TDCIPP),磷酸三(2-氯异丙基)酯(TCIPP)混合使用于家具、汽车泡沫、婴儿产品材料聚氨酯泡沫塑料中[5-7].由于其非化学键合特性,V6在产品使用周期内容易浸出而进入环境.近期,V6陆续被检出于多种环境介质(灰尘、水体、沉积物、土壤等)[1,8-10],如Fang等[8]在室内灰尘和汽车灰尘样品中均检出了V6,检出浓度范围分别为<5～1110ng/g(中位数为12.5ng/g)和5～6160ng/g(中位数为103.0ng/g),这增加了人体暴露于V6的风险.有研究报道已经发现V6检出于人体样品,如手指甲[7].欧洲化学管理署发现V6可显著降低大鼠血清胆碱酯酶活性,表明其可能具有类似其他OPEs的神经毒性[5].美国国家环境保护局(US EPA)危险化学品评估认为V6对人类具有多种潜在生物效应,如遗传毒性、生物毒性、神经发育毒性等[11].因此,系统评估V6的人体健康风险便成了当下亟需解决的问题.生物转化是外源性物质在生物体内毒性变化的最重要决定因素之一,在环境毒理学和风险评估中发挥着越来越重要的作用[12].因此,研究V6的代谢转化规律对于系统评估V6人体健康风险便显得尤为重要.

目前,关于V6的代谢研究较少,仅Alves等[6]在2018年报道了人肝微粒体和S9代谢V6生成的13种代谢产物,包括O-脱烷基、氧化脱氯、羟基化和硫酸盐产物.除此之外,V6的生物代谢研究仍有一些问题值得探索: V6代谢体系是否存在其他未知代谢产物,这对于准确评估V6的毒性效应极为重要; OPEs部分代谢产物似乎具有高于母体的生物毒性[13],如Su等[14]证实磷酸三苯酯(TPHP)的二酯产物磷酸二苯酯(DPHP)可以诱导更多基因的异常表达.

高分辨质谱仪(HRMS)以其质量范围宽、扫描速度快、灵敏度高等优势,被广泛应用于低浓度已知或未知化合物的定量检测,复杂组分的痕量分析等方面,逐渐在环境样品的可疑/未知化合物方面发挥重要的识别作用[15].基于HRMS开发的可疑和非靶向识别技术具有高通量的优势,拓展了传统靶向分析的广度,已广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域[16-19].借助于此识别技术,环境化学家在不同环境介质中不断发现新型污染物[20-23],甚至未知的代谢产物[24-26]等,这为全面识别生物体系中V6代谢产物提供了技术支撑.

本研究基于静电场轨道阱高分辨质谱仪(Orbitrap-HRMS),重新评估了人肝微粒体对V6的代谢规律,主要研究工作包括:探究是否存在新型代谢产物;基于代谢产物,构制V6完整代谢路径图;探究新颖代谢产物含量随时间变化趋势,该研究成果将为寻找V6新生物标志物和评估其毒性效应提供数据支撑.

1 材料与方法

1.1 实验药品

图1 V6的化学结构

V6(化学结构见图1)和内标d15-TDCIPP购自于AK Scientific公司(Union city,CA,USA),50供体混合性别人肝微粒体(HLM)来自于BioreclamationIVT公司(Westbury,NY,USA),其酶活见表1.磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和乙酸铵均购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA).实验中使用的所有溶剂均为色谱纯,购自Tedia公司(Fairfield,OH,USA).

表1 HLM中CYP450s酶活

1.2 V6孵育实验

孵育体系包括563μL的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)、30 μL的20mg/mL HLM蛋白(反应浓度1mg/mL)和1μL的30mmol/L V6储备液(反应浓度1mmol/L,含有<1%的二甲基亚砜(DMSO)),该混合液在恒温水浴箱中37℃、120r/min下预孵育5min,然后加入6μL的100mmol/L NADPH(反应浓度1mmol/L)启动反应.反应1h后,向体系中补充等体积NADPH以充分反应.在0, 0.5, 1.0, 1.5和2.0h间隔时间点取样,每次取样100μL,反应液移至干净玻璃管中,然后加入400μL含有12.5ng内标的冰冷乙腈以终止反应.然后将混合液涡旋15s后3500r/min离心10min,取400μL上清液至另一个干净玻璃管中,氮吹浓缩至100μL,经0.2μm离心过滤器(COSTAR, CN:8169)过滤后待上样分析.

为确保实验数据准确可靠,本实验设置了阳性对照、阴性对照和空白对照.阳性对照体系中,以备受关注的磷酸三苯酯(TPHP)替代V6,以检查代谢系统的稳健性;阴性对照以等体积的PBS替代HLM或NADPH;而空白对照是以等量的DMSO替代V6;其他实验条件同上.

1.3 仪器条件

V6及其代谢产物分析仪器为超高效液相色谱-Orbitrap 高分辨质谱联用仪(Thermo Fisher Scientific公司,Waltham,MA),分离柱为Eclipse Plus C18(50mm×2.1mm×3.5µm,Agilent,USA),柱温为35℃.流动相为水(A)和甲醇(B),两相均含有2mmol/L乙酸铵,流动相流速为0.45mL/min.洗脱梯度为:初始5% B,保持1min;2min内增加至50% B;然后7min内增加至100% B,保持8min;然后在0.1min内回到初始条件,保持到23min.进样体积为5μL.Orbitrap-HRMS质谱条件如下:离子源采用电喷雾电离(ESI),正离子模式,喷淋电压+3500V,鞘气压35任意单位(arb),辅助气压10arb,毛细管温度320℃,辅助气加热温度425℃,离子扫描模式Full MS-AIF、选择离子监测(SIM)和平行反应监测(PRM),模式参数如下:扫描范围50～750/,分辨率35000;碰撞能量(NCEs)10, 20, 40eV.

1.4 V6及其代谢产物筛查策略

图2 V6及其代谢产物的靶向-可疑筛查策略流程

分为两个步骤(图2):1)基于标准品V6,运用Orbitrap-HRMS的SIM模式进行定量分析;2)基于已报道OPEs的代谢路径,即羟基化、O-脱烷基,氧化脱氯,氧化作用[6],列出V6所有可疑代谢产物名单.可疑筛查基本流程:1)Full MS-AIF模式下获得V6代谢前后色谱图和质谱图;2)用TraceFinder软件分析其色谱图和质谱图,找出可疑产物的化学式,并与可疑数据库中化合物进行匹配,将相应化合物列为候选物质.此步骤中,需要遵守代谢产物筛查标准:a)信噪比/>10;b)测定离子质荷比(/)和目标性离子/的质量误差(Δmass)<10´10-6;c)阴性对照中相同保留时间无明显峰;d)所有的离子碎片是合乎逻辑且可解释的;3)运用Orbitrap-HRMS的PRM模式获得二级碎片信息,进一步推测潜在代谢产物的化学结构.

1.5 数据分析

采用Xcalibur v2.2和TraceFinder v3.3软件(Thermo Fisher Scientific,Bremen, German)定性定量分析V6及其代谢产物.采用ChemDraw 2004软件绘制代谢产物的化学结构和代谢路径图.代谢产物随孵育时间的相对响应强度采用EXCEL 2010进行处理,所得数据用GraphPad Prism 5软件进行绘制.不同时间点的代谢产物相对响应强度差异采用Student’s-test进行分析.

2 结果与分析

2.1 V6代谢体系中新型代谢产物的发现及鉴定

基于Orbitrap-HRMS,在HLM孵育体系中,一共发现了11种V6代谢产物(表2).其中,5种被标为M1～M5的代谢产物已有报道.本研究发现了6种从未被报道过的代谢产物,即M6 (/578.9252,RT= 4.97min,Δmass=-3.215´10-6),M7(/516.9329,RT= 3.60min,Δmass=-3.082´10-6),M8(/562.9303, RT= 5.96min,Δmass=-0.286´10-6),M9(/500.9380, RT= 4.51min,Δmass=4.104´10-6),M10(/578.9252,RT= 4.75min,Δmass=1.014´10-6)和M11(/542.9486, RT= 5.12min,Δmass=-1.973´10-6).

基于6种新型代谢产物的MS/MS质谱图和母体V6的化学结构(图1),进一步推测了其具体化学结构,结果如图3所示.M6有3个特征离子,即/358.9527 [C9H16Cl4PO4]+,354.9658 [C9H15Cl3PO6]+和234.9684 [C5H10Cl2PO4]+.碎片离子/358.9527可分为连接两个磷酸基团的链(下称连接链) [C5H8Cl2]+和一个含有两个烷基链的磷酸[C4H8Cl2PO4]+;离子/234.9684为连接链[C5H8Cl2]+和磷酸[H2PO4]+;离子/354.9658可分解为[C5H8Cl2]+和[C4H7ClPO6]+,表明了磷酸烷基链中的一个氯原子被羧基取代.基于此,M6被推测为羧基化合物.M7的分子量为516.9329,比M6少62Da,证明了M6通过O-脱烷基作用转化为M7.M7的二级碎片离子/296.9610 [C7H13Cl3PO4]+比M6的碎片离子/354.9658少[C2H4Cl]+,进一步表明了磷酸基团上的一个烷基链被去除.同M6,M7也产生了碎片离子/234.9684和354.9670,证明一个羧基基团可能位于另一个磷酸基团的烷基链上.因此,M7为羧基产物,其羧基位于一个磷酸基团上,而另一个磷酸基团上缺少一个烷基链.M8能生成/338.9713 [C9H15Cl3PO5]+、/276.9790 [C7H12Cl2PO5]+和/214.9868 [C5H9ClPO5]+3个特征碎片.碎片离子/338.9713进一步可分为[C4H8Cl2PO4]+和[C5H7ClO]+,其中[C4H8Cl2PO4]+为含有2个烷基链的磷酸结构,而[C5H7ClO]+为连接链[C5H8Cl2]+上的一个氯原子被氧化为醛基.碎片/276.9790和214.9868也含有碎片[C5H7ClO]+,进一步印证了连接链上醛基的存在.基于此,M8被鉴定为醛基产物,其醛基位于连接链上.M9的特征碎片/140.9945 [C2H6PO5]+可分为[C2H4O]+和[H2PO4]+,表明了含有两个烷基的磷酸上的一个氯代烷基链氧化脱氯,并脱去另一个烷基链.因此,M9被推测为醛基产物,其磷酸上一个氯原子被氧化为醛基,另一个烷基通过O-脱烷基作用被去除.M10的分子量和M6相同,表明这2个化合物可能是同分异构体.M10的碎片离子/230.9816可分为[C5H7ClO2]+和[H2PO4]+,表明了连接链[C5H8Cl2]+的一个氯原子被氧化为羧基基团.M10的另一个碎片/354.9661也含有碎片[C5H7ClO2]+,也印证了这个推测.因此,M10为羧基基团位于连接链上的氧化产物.M11的二级碎片/195.0051能分解成[C5H6O2]+和[H2PO4]+.与连接链[C5H8Cl2]相比, [C5H6O2]+结构少了2个[HCl],多了2个[O],表明了连接链上的2个氯原子被氧化为醛基.另一个碎片/256.9966可分为[C2H5ClPO4]+和[C5H6O2]+,进一步印证了这个推测.因此,M11被推测为二醛基产物,其两个醛基均位于连接链上.

表2 HLM代谢体系中V6的潜在代谢产物

综上所述,M6、M7和M10为羧基产物,而M8、M9和M11为醛基产物,这可能由肝微粒体含有乙醇脱氢酶和醛类脱氢酶作用生成的[27].这与以前的研究结果相一致,如Van den Eede等[27]发现TDCIPP、TCIPP和磷酸三(2-丁氧基)乙酯(TBOEP)可以被HLM转化为相应的羧基和/或醛基代谢物.Alves等[6]推测V6的氧化脱氯代谢物可能被转化为醛中间体和羧酸,但未得到证实.Wang等[28]研究了6种典型的OPEs在成年斑马鱼体内的代谢及其主要代谢物分布,其中5种可代谢为酮/醛代谢物和羧基代谢物.

图3 V6的6种新型代谢产物结构鉴定

2.2 新型代谢产物生成路径的推导

结合Alve等[6]推导的V6I相和II相代谢路径及Van den Eede等[27]推导的几种常见OPEs(如与V6结构相似的TDCIPP)的代谢路径,本研究推导了6种新型代谢产物的生成路径(图4).路径I,O-脱烷基化反应导致烷基链C-O键断裂,生成代谢物M1;随后M1发生氧化脱氯,生成M3;M3一方面可以进一步氧化为羧基代谢物(M7),M3的羟基也可能进一步脱氢,生成M9等醛类代谢物.路径II,V6首先通过氧化脱氯生成羟基化代谢产物M4;然后M4可以进一步氧化为羧基化合物M6;M6的O-脱烷基反应生成M7.路径III,V6的氧化脱氯导致M8的形成;随后M8可以进一步氧化为羧基代谢物M10或二醛代谢物M11.

结合Alve推导的V6代谢路径[6],可知V6首先被代谢为羟基化产物,随后羟基化产物被氧化为醛基产物,进一步被氧化为羧基产物.据报道,许多有机污染物的羟基化产物具有比母体更大的毒性[29-30];当羧基存在时,可显著降低物质毒性[31],因此,转化产物对V6毒性变化有重要影响.后续研究应在关注V6的同时,也要关注其代谢产物.

图4 6种新型代谢产物在HLM中的可能生成路径

M1,M3和M4为已报道过的代谢产物

2.3 新型代谢产物随时间变化趋势

如图5所示, M6含量在2.0h孵育时间内,呈现稳步增加趋势;在反应1.5h后,M6的生成量与0h相比,增加量明显(<0.05).在0.5h可以明显观察到M6的含量,而与此同时M7几乎没有产生,说明M6的产生早于M7,这与之前推测M6是M7的前驱物是一致的.M7的含量从0.5h到1.0h缓慢增加,然后从1.0h到1.5h暂时下降,可能是由于M7进一步代谢所致,随后在1.5～2.0h的孵育时间内,M7呈现快速增加的趋势,可能是因为大量的前体(M6)加速次级代谢产物(M7)的积累.与M7相似,M9的生成量在后孵育阶段1.5～2h也比前孵育阶段0～1.5h明显加快(<0.05),这种变化趋势与M3相似,证实了M3与M9之间可能存在转化.M8的含量从0h到1.5h成线性增加,随后从1.5～2.0h产量显著降低,这与本研究推导的M8可以被进一步转化为次生代谢物M10和M11结论一致.M10和M11的含量在孵育时间2h内均呈现增加趋势,表明M8向M10和M11的转化明显.M10在0.5h开始有检出,而M11在0.5h有明显的生成量,这说明醛中间体(M8)更容易转化为羧基产物(M11).

综上所述,除醛基产物M8外,其余5种新型代谢产物在2.0h内均有所富集.事实上,醛类、羧酸类化合物也是其他OPEs的常见代谢产物[27,32-33].另外,目前关于OPEs代谢路径表明羧基产物是可发现的末端产物[27,32],因此,OPEs的羧基产物可能是其暴露于人体的新型生物标志物.基于这一点,人体样品中V6羧基代谢产物含量及其在人体内归趋需要加强研究.

图5 6种新型代谢产物相对响应随孵育时间变化趋势

基于0h初始值分析不同时间点显著性差异(<0.05, *;<0.01, **); 相对响应由代谢产物的峰面积除以内标d15-TDCIPP的峰面积计算所得

3 结论

3.1 本研究首次发现了V6的6种醛基和羧基代谢产物,其由初级代谢产物(脱烷基和羟基化产物)进一步转化而成.

3.2 5种新识别代谢产物含量在孵育时间稳定增加,这为寻找V6新生物标志物提供借鉴.

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Biotransformation of an organophosphate flame retardant V6 based on suspect screening technique.

LI Jian-hua, ZHANG Ya-yun, MENG Wei-kun, SU Guan-yong*

(Jiangsu Key Laboratory of Chemical Pollution Control and Resources Reuse, School of Environmental and Biological Engineering, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, China)., 2022,42(9)：4409～4415

This study studied metabolism of V6 in human liver microsomes (HLM) using Orbitrap high-resolution mass spectrometer (Orbitrap-HRMS). With the exception of 5 reported metabolites including O-dealkylated, oxidative de-phospherylated and O- dechlorinated compounds, 6 novel products were firstly observed. Based on their MS/MS spectra, these newly discovered metabolites were identified as aldehyde and carboxyl products. Of them, 5 metabolites can be accumulative according to their linearly increasing tendency inexperiment. In addition, the proposed metabolic pathway demonstrated the primarily metabolites, i.e. dealkylated and hydroxylated metabolites were further transformed into secondary metabolites, i.e., aldehyde and carboxyl metabolites.

organophosphate flame retardant of emerging concern；human liver microsomes；high-resolution mass spectrometer；metabolism；biotransformation rule

X503.2

A

1000-6923(2022)09-4409-07

2022-02-25

国家自然科学基金资助项目(22006068,21976088);江苏省杰出青年基金项目(BK20211521);中国博士后科学基金项目(2021M690079);江苏省博士后科研资助(2021K174B);中央高校基本科研业务费专项资金资助(30920021115)

*责任作者, 教授, sugy@njust.edu.cn

李建华(1986-),女,河南许昌人,副教授,理学博士,主要研究方向为新型环境污染物的识别及其在生物体内的迁移转化.发表论文20多篇.