Cariporide对癫痫模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

马鹏飞，彭爽，谢懂君，吴旭玲，郑乾，冯占辉

癫痫是临床常见的慢性疾病[1]。全世界约有9 000万癫痫患者，其中30%属于难治性癫痫，而在我国每年新增患者约为45万[2-3]。据世界卫生组织报道，癫痫患者死亡率约为正常人群的2倍[4]。有研究显示，约88%的癫痫患者在癫痫发作中死亡[5]。因此早期干预及减少癫痫猝死是临床面临的主要问题。有研究显示心律失常与癫痫发作密切相关。颞叶癫痫发作会导致以交感神经或者副交感神经过度活跃为主的自主神经功能障碍[6]。

Cariporide是钠氢交换体 1(sodium hydrogen exchanger,NHE-1)的抑制剂，具有抗心律失常作用[7-8]。有学者发现其可以降低再灌注时室速和室颤的发生率以及大鼠的死亡率[9]。课题组前期研究发现，NHE-1在癫痫模型鼠心脏表达增高，考虑该蛋白与心肌细胞凋亡密切相关[10]。为此，本文探讨Cariporide是否能够通过下调NHE-1来减少癫痫模型大鼠心肌组织凋亡情况，以期为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验设备及试剂

匹罗卡品和氯化锂(美国Sigma公司)，地西泮注射液(成都倍特公司)，NHE-1抗体(美国Abcam公司)，β-actin抗体(上海钰博生物科技有限公司)，Cariporide(碧云天生物技术有限公司)，山羊抗兔二抗(中杉金桥)，RNAisoPlus 和 PrimeScript 逆转录试剂盒(日本 TakeraBio公司)，显色剂(ECL，美国 Pierce公司)，PM20自动显微镜(日本奥林巴斯)。

1.2 模型制作

建立癫痫大鼠模型[8]，腹腔注射氯化锂，剂量为127 mg/kg，20 h后腹腔注射硫酸阿托品，剂量为1 mg/kg，30 min后腹腔注射匹罗卡品，剂量为50 mg/kg，用药后观察大鼠行为学改变，以Racine分级作为标准。RacineⅣ级及以上发作持续1 h后，应用地西泮终止癫痫发作，剂量为10 mg/kg。

1.3 实验动物及分组

选取Sprague Dawley(SD)雄性大鼠共45只，随机分为模型组30只及对照组15只，模型组中随机选取15只作为干预组。干预组采用Cariporide(1 mg/kg)每天一次灌胃，连续用药4周。对照组及模型组采用等量生理盐水注射。在自发性癫痫发作开始后第60天麻醉处死大鼠后取心肌组织，应用蛋白印迹和RT-PCR检测 NHE-1的表达，进一步采用流式细胞检测大鼠心肌细胞凋亡情况。

1.4 Western blot 方法

第60天取模型组和对照组大鼠各6只，应用10%水合氯醛，剂量为300 mg/kg，麻醉后断头处死，快速分离心肌组织，置于液氮中快速冷冻，然后储存于-80 ℃冰箱中。取心肌组织提取蛋白(按试剂盒要求)，检测蛋白浓度，提取50 μg蛋白进行电泳，然后电转到于8%SDS-PAGE上电泳，电转到聚偏二氟乙烯膜上；室温5%BSA孵育聚偏二氟乙烯膜1.5 h，加入兔抗大鼠NHE-1(1∶4 000)和β-actin(1∶1 000)孵育聚偏二氟乙烯膜4 ℃过夜；第2天室温下孵育NHE-1膜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h。加入增强型化学发光试剂显色试剂对蛋白条带进行显影。用QuantityOne 4.6.2软件分析NHE-1的相对含量，β-actin作为内参[9]。

1.5 RT-PCR 检测方法

第60天取模型组和对照组大鼠各6只，采用RT-PCR方法检测大鼠心肌NHE-1mRNA的表达。按试剂盒说明书，提取总RNA，应用分光光度法测定RNA浓度和纯度。采用逆转录试剂盒合成cDNA。由TakaraBio设计合成RT-PCR引物。选择GAPDH为管家基因：F-引物5′-CCCCCAAT GTATCCGTTGTG-3′和R-引物5′-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；大鼠NHE-1基因：F-引物5′-GCGGCGAGCAGATCAATAA-3′和R-引物5′-ACAGTGACGGCATCGTTGAG-3′[8]。

1.6 流式细胞检测

取1 g心肌组织滤纸拭干，加生理盐水进行2次洗涤，然后将心肌组织剪碎，大小约1～3 mm3；进一步加入0.25 g/100 mL的胰蛋白酶5 mL进行消化，然后采用恒温水浴，再用尼龙网过滤，进一步以800 r/min离心；丢弃上清液，70%乙醇中固定，将上清液丢弃，用冰生理盐水漂洗2次，保证细胞数在1×106个/mL，加入碘化丙啶染液1.0 mL，置于4 ℃恒温箱中30 min，最后检测。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 模型的制作

30只SD大鼠用于制作模型鼠，制作模型过程中死亡7只(模型组死亡3只，干预组死亡4只)，死亡率为23%。

2.2 Western-blot检测

第60天模型组大鼠心肌细胞NHE-1蛋白表达较对照组增高，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组NHE-1蛋白表达较模型组降低(P<0.05)。详见图1。

注：模型组和干预组与对照组比较，*P<0.05;干预组与模型组比较，*P<0.05。图1 各组大鼠心肌细胞NHE-1的Western-blot检测结果

2.3 RT-PCR检测

RT-PCR 检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞NHE-1 mRNA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组大鼠NHE-1 mRNA表达水平较模型组降低(P<0.05)。详见图2。

2.4 流式细胞检测

经流式细胞检测结果显示，模型组大鼠心肌细胞凋亡率较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组大鼠心肌细胞凋亡率较模型组降低(P<0.05)。详见图 3。

注：模型组和干预组与对照组比较，*P<0.05;干预组与模型组比较，*P<0.05。图3 各组大鼠心肌细胞的流式细胞检测结果

3 讨论

癫痫是大脑皮层神经元同步过度放电所导致的一类疾病，临床以反复抽搐为主要表现。在发作过程中患者可出现癫痫猝死，有研究显示，心源性猝死是癫痫猝死的重要原因，然而导致癫痫猝死的机制目前尚不清楚[4-5]，为进一步探讨慢性癫痫患者心肌细胞是否出现异常，课题组前期制作慢性癫痫鼠模型，分析慢性癫痫模型鼠第60天时心肌细胞的凋亡情况，明确 NHE-1 的表达特点以及细胞凋亡情况，发现心肌细胞在第60天时凋亡明显[10]。本研究进一步采用NHE-1抑制剂Cariporide处理模型大鼠，结果显示干预组大鼠心肌细胞 NHE-1蛋白和mRNA 表达均下降，同时也发现心肌细胞凋亡率较模型组明显降低。

基于上述研究结果，课题组认为在癫痫反复发作的情况下，心脏也不断受到影响，有研究报道心脏会出现心律失常[11]。而这种心律失常可能与NHE-1调节功能紊乱有关。而心肌细胞可能会在癫痫发作反复出现的情况下，出现细胞内 Ca2+信号通路功能过强的问题，从而加剧心肌细胞凋亡的发生[12-13]。抑制NHE-1的功能有助于减少心肌细胞的损害。NHE-1 属于膜蛋白，在心肌组织中表达广泛[14]。其主要功能是稳定细胞内的酸碱平衡，维持细胞内的稳态。当心肌细胞出现应激状态时，会促使NHE-1的功能增强，心肌细胞NHE-1被激活，将H+排出，Na+摄入进来，以此恢复心肌细胞生理pH值[15]。

凋亡是细胞应对外界环境改变的一个缓慢调节过程[16]。如果心肌细胞过度凋亡，必然会导致心肌调节功能的障碍，患者在某一次癫痫发作过程中，心肌有可能因为收缩功能障碍而出现停搏[17]。因此能否通过抑制NHE-1达到减少凋亡的发生也是一个重要的问题。既往有研究显示，NHE-1抑制剂可以减少心肌细胞凋亡，可能与线粒体渗透性转换有关，本研究结果与Javadov等[18]的研究结果一致。

结合课题组前期的研究结果，有理由认为癫痫的反复发作会诱导心肌细胞的凋亡，这个过程是个慢性病程，但是一旦癫痫持续状态出现，心肌细胞的收缩功能可能出现严重问题，并可出现心律失常[19]。心肌细胞的凋亡可能在心律失常的发生中起到重要作用，例如在心脏停搏、房颤及室颤中的发生[20-21]。

综上所述，本研究认为慢性癫痫患者在不断的癫痫发作中，可能会出现心律失常，同时心肌细胞慢性凋亡增加，早期下调NHE-1的表达有助于减少心肌细胞的凋亡，减少癫痫猝死的可能。