198 例儿童哮喘4 种基因多态性分布特征及个体化治疗效果分析

刘勇 陆婉秋

哮喘是常见的慢性气道疾病，其临床表现主要为反复喘息、咳嗽、气促和胸闷，通常在夜间和（或）凌晨发作或加剧。哮喘严重影响患儿健康，并给社会带来沉重的负担，以及对家庭和主要照顾者都有一定程度的负面影响。目前大多认为哮喘是一种由免疫、遗传、环境等因素导致的多因素疾病，其遗传与多个基因位点有关。研究者报道，IL-13 基因R110Q（IL-13 R110Q）、IL-4 基因-590C>T（IL-4-590C>T）、β肾上腺素能受体基因R16G（ADRB2 R16G）、IgE 高亲和力受体β 链基因E237G（FcER1B E237G）组成的四位点模型是哮喘易感基因的最佳预测模型。单核苷酸多态性与药物治疗关系密切，并且与哮喘的易感性及其严重程度有关。刘艳琳等研究显示，实现哮喘个体化治疗需要以药物基因检测作为方向，然而，目前国内相关临床数据有限，仍然需要大样本研究来获取更可靠的临床数据。本研究主要分析了198 例儿童哮喘4 种相关基因（IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G）的多态性，描述哮喘儿童的遗传特征，观察并分析了哮喘相关药物基因检测结果指导哮喘患儿个体化治疗后的临床疗效，进而为哮喘患儿的个体化治疗提供临床数据支持。

对象与方法

一、研究对象

选取2019 年7 月到2021 年9 月在贵州医科大学附属医院儿科门诊确诊的396 例非急性发作期轻-中度哮喘儿童作为研究对象。干预组198例，行四基因位点的多态性及哮喘药物基因检测；对照组198 例，未行四基因位点的多态性及哮喘药物基因检测。入组标准：①非急性发作期的轻-中度哮喘儿童，哮喘的诊断及分级标准参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016 年版）》；②初诊支气管哮喘且未规范治疗；③贵州省内本地居民。排除标准：合并引起咳嗽、喘息为主要症状的其他疾病，包括支气管异物、肺结核、先天性心脏病、先天性呼吸系统畸形、支气管狭窄、胃食管反流病、先天性免疫缺陷病等。此研究经贵州医科大学伦理委员会批准［批件号：2021 伦审第（155）号］，所有患儿的监护人均已签署知情同意书。

二、方 法

1. 干预组DNA 的提取

干预组行四基因位点的多态性及哮喘药物基因检测。收集患儿口腔双侧内腮颊黏膜拭子，并置于专用离心管，−20 ℃冰箱保存，送至上海解码医学检验所，应用天根口腔拭子基因组DNA 提取试剂盒（美国Agena Bioscience 公司），按试剂盒说明书步骤提取DNA。

2. 基因多态性分析

将提取的DNA 样本经过PCR、扩增、纯化、引物延伸、纯化、点样等步骤，最后运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS） 对IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 4 个哮喘易感基因位点的单核苷酸多态性（SNP）进行基因分型。其中IL-13 R110Q位点有3 种基因型，分别为AA、AG、GG；IL-4-590C > T 位点有3 种基因型，分别为TT、CT、CC；ADRB2 R16G 位点有3 种基因型，分别为AA、AG、GG；FcER1B E237G 位点有3 种基因型，分别为AA、AG、GG。将4 个基因位点均不携带风险等位基因纯合子者定义为哮喘基因检测阴性，任一基因位点携带风险等位基因纯合子者定义为哮喘基因检测阳性。

3. 药物基因检测

对常见的三大类支气管哮喘控制药物基因［包括糖皮质激素诱导转录因子1（GLCCI1）基因 rs37973、低亲和力IgE 受体（FcER2）基因rs28364072、促肾上腺皮质激素释放激素受体1（CRHR1）基因 rs242941、细胞色素氧化酶P450 3A5（CYP3A5）基因 rs776746、ADRB2 基因rs1042713、ⅩⅩⅡ型α1 链胶原（COL22A1）基因rs6988229、CRHR2 基因 rs7793837、腺苷酸环化酶9（ADCY9）基因 rs2230739、白三烯C4 合成酶（LTC4S） 基因 rs730012、5-脂氧化酶（ALOX5）基因 rs2115819］进行治疗反应检测，最终得到个体化用药提示结果，并分为疗效较好、疗效欠佳2 类。

4. 治疗方法

干预组与对照组的吸入性糖皮质激素（ICS）治疗方案均按照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016 年版）》执行，在治疗随访期间根据患儿病情适当加用硫酸沙丁胺醇吸入气雾剂。个体化治疗方案中的药物包括3 大类：①糖皮质激素（激素），如丙酸氟替卡松、布地奈德、二丙酸倍氯米松；②β受体激动剂，如沙美特罗、福莫特罗、沙丁胺醇；③白三烯调节剂，如孟鲁司特。干预组根据哮喘药物基因检测的结果选择上述疗效较好的ICS 治疗。其中经丙酸氟替卡松吸入气雾剂治疗90 例、布地奈德治疗60 例、二丙酸倍氯米松治疗48 例。对照组使用的激素类型同干预组，其中丙酸氟替卡松吸入气雾剂治疗90 例、布地奈德治疗60 例、二丙酸倍氯米松治疗48 例。药物用量与用法：丙酸氟替卡松吸入气雾剂1 揿/次，早晚各1 次；吸入用布地奈德混悬液1 mg/次，早晚各1 次；丙酸倍氯米松吸入气雾剂2 揿/次，早晚各1 次。

5. 观察指标

根据患儿的年龄选择以下相应的哮喘控制评估工具对个体化治疗后的疗效进行评价：①哮喘控制测试（ACT）评分，适用于≥12 岁的患儿，评分范围5～25 分，≤19 分为控制不佳，20～24 分为良好控制，25 分为完全控制。②儿童哮喘控制测试（C-ACT）评分，适用于4～11 岁的患儿，评分范围5～27 分，24～27 分为哮喘完全控制，20～23分为哮喘部分控制，≤19 分为哮喘未控制。③儿童呼吸和哮喘控制测试（TRACK）评分，适用于≤5 岁的患儿，< 80 分为控制不佳，≥80 分为哮喘控制。考虑本研究中C-ACT 与TRACK 两个评分工具有年龄重叠，故统一年龄 ≤5 岁的患儿采用TRACK评分进行评价，年龄6～11 岁的患儿以C-ACT 进行评价。分别于入组时、治疗1 个月、治疗3 个月对患儿进行问卷评分。

三、统计学处理

结 果

一、干预组与对照组患儿的性别构成和年龄比较

干预组198 例患儿中，男133 例、女65 例，年龄（4.4±2.7）岁。对照组198 例患儿中，男128例、女70 例，年龄（4.6±2.8）岁。2 组患儿的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义（P 均>0.05）。

二、干预组患儿哮喘相关基因多态性分析

干预组患儿IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 基因型的频数和频率见表1，IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 等位基因的频数和频率见表2。IL-13 R110Q 基因实际频数与预期频数对比=0.068，P = 0.794；IL-4-590C>T 基因实际频数与预期频数对比=2.462，P = 0.117；ADRB2 R16G 基因实际频数与预期频数对比= 5.760，P = 0.016；FcER1B E237G 基因实际频数与预期频数对比=0.967，P = 0.325，位点分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群体代表性。IL-13 R110Q 位点风险基因型GG、IL-4-590C>T 位点风险基因型TT、ADRB2 R16G 位点风险基因型AA 的比例较高，而FcER1B E237G 位点的风险基因型GG 比例最低。经哮喘基因检测结果提示，阳性134 例、占67.7%，阴性64 例、占32.3%。

表1 干预组198 例哮喘患儿IL-13、IL-4、ADRB2、FcER1B 基因型频数及频率

表2 干预组198 例哮喘患儿IL-13、IL-4、ADRB2、FcER1B 等位基因频数及频率

三、干预组与对照组的疗效分析

入组时，2 组ACT、C-ACT 和TRACK 评分比较差异均无统计学意义（P 均> 0.05）。治疗1 个月后，干预组C-ACT、TRACK 评分均优于对照组（P 均> 0.05）；治疗3 个月后，干预组的哮喘控制评分均优于对照组（P 均< 0.05），见表3。

表3 ICS 治疗前后干预组与对照组的哮喘控制评分比较（x±s） 单位：分

讨 论

儿童哮喘的患病率呈逐年上升趋势。越来越多的研究显示，哮喘的发病机制是多种基因、免疫和环境因素共同作用的结果。近年来，国内外许多学者对哮喘相关基因进行了大量的研究，尤其是随着全基因组关联研究的广泛开展，迄今已发现近1000 个哮喘候选基因。我国鲍一笑教授团队通过大量研究发现，由IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 组成的4位点模型是最佳的儿童哮喘易感基因预测模型，并且该模型与哮喘预测指数和特应性相关，推测其可作为预测学龄前喘息儿童未来是否会发展为哮喘的有力工具，该团队提出基因多态性对药物治疗反应差异的影响是未来个体化药物治疗的一个主要研究方向。

1 型辅助性T 淋巴细胞（Th1）/ Th2 失衡是哮喘主要的免疫发病机制，Th2 产生的IL-13 和IL-4 起了重要的作用。多项研究表明，IL-4 基因和IL-13 基因与儿童哮喘密切相关，曹华等研究显示，导致儿童哮喘的主要因素是IL-4 基因和IL-13基因之间的相互作用。舒磊等研究报道，IL-13 rs20541（即 R110Q）SNP 与哮喘患儿的发病呈强相关。廖兴娟等报道，IL-4-590C/T 位点的多态性可能与贵阳地区的儿童哮喘有关。

目前，对ADRB2 基因的研究主要集中在编码区第16 和第27 位的多态性，但是各种报道的结果并不完全一致。冯媛元等的研究表明，ADRB2基因的rs1042713 位点，即ADRB2 R16G 多态性，不仅与儿童哮喘的易感性有关，而且在一定程度上影响哮喘患儿对治疗的反应。 但陈更业等研究表明，β-2AR 基因16 位点基因多态性和中国汉族儿童哮喘易感性无关。一项关于沙特阿拉伯哮喘人群的研究亦报道ADRB2 基因SNP 与哮喘无关。上述研究显示ADRB2 基因SNP 分布不一致的原因可能是不同地域和环境存在差异。

FcER1B 主要参与IgE 介导的Ⅰ型超敏反应，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放炎症介质和分泌细胞因子。郭素华等研究报道，儿童喘息的发病和FcER1β 基因多态性有关，风险型基因不仅是喘息的危险因素，而且影响喘息发作的严重程度，但并非哮喘的主导因素。刘婷等研究显示，哮喘、特应性与E237G 基因突变可能无关。

随着我国儿童哮喘相关标准与指南的推出并不断更新，大部分儿童哮喘得到有效控制，但仍有部分哮喘患儿难以控制，随着药物基因组学的开展，这为儿童哮喘个体化治疗提供了方向。多项研究利用基因检测临床指导哮喘患儿的个体化治疗，均取得一定的成效。

本研究显示，IL-13 R110Q 位点风险基因型GG、IL-4-590C/T 位 点 风 险 基 因 型TT、ADRB2 R16G 位点风险基因型AA 的比例较高，而FcER1B E237G 位点的风险基因型GG 比例最低，是否表明FcER1B 基因不是本地区儿童哮喘发病的因素，这仍需要大样本数据的支持。另有研究显示，哮喘患儿哮喘基因检测阳性者占67.7%，在临床工作中哮喘基因检测可考虑作为预测哮喘风险的检查之一。本研究同时通过哮喘药物基因检测结果为患儿制定ICS 个体化治疗方案后，治疗后3 个月干预组患儿的哮喘控制评分均优于对照组，这为本地区儿童哮喘的精准治疗提供了一定的临床数据支持。然而，目前尚缺乏利用药物基因组学指导儿童哮喘治疗的大样本研究，期望未来开展更多人群、更多位点的研究，最终实现儿童哮喘精准医疗的目的。