高效液相色谱法测定土壤中烷基酚残留

曹志秀(实朴检测技术(上海)股份有限公司，上海 201108)

0 引言

烷基酚类化合物(Alkylphenols, APs)是一种具有生物毒性的内分泌干扰物，可在环境中长期存在，难降解，具有很强的雌激素活性，通过环境进入人体后富集，严重干扰生物的生殖发育，造成诸多不利影响[1-2]。其作为重要的化工原料，由人工合成，广泛用于各行各业中，如：塑料生产、工业用洗涤剂、食品及化妆品包装材料、医疗器械等诸多领域[3]，且使用量巨大，从而通过多种途径残留在空气、水、土壤中，并迁移、蓄积，严重污染人们的日常生活环境。尤为严重的是，食品包装中的烷基酚原料会通过食物直接进入人体，危害人类健康[4]。目前，国外很多组织协会都已对烷基酚类化合物尤其是壬基酚和辛基酚提出了限值规定[5]。

我国是烷基酚使用大国，预防和控制烷基酚污染尤为重要。但国内暂无正式发布的对环境土壤中APs的分析方法标准，相关报道也很少，纺织品、食品和化妆品等行业有APs相关分析方法的标准和报道，其中对双酚A、壬基酚和辛基酚的研究较多[6-7]，前处理方式主要有索氏提取、超声提取、振荡提取。其中索氏提取法花费时间长，过程繁琐，需要消耗大量有机溶剂，会产生大量有害废液。振荡提取可能会造成目标物损失。而利用超声波提取可保证提取效率，且操作简单高效，是提取方法的理想选择。仪器分析方法集中在气相色谱质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液 相 色谱-串联 质 谱 法(HPLC-MS-MS)。GC-MS法在分析样品前一般需要衍生化处理，增加了实验过程的复杂性，影响方法稳定性，对实验操作要求高[8]。HPLC-MS-MS法灵敏度高、定性准确、检出限低，但对仪器性能要求高，操作不易掌握[9-11]。HPLC法的原理简单，无需高温汽化，无需衍生，无需优化质谱条件，且实验成本低，仪器稳定性强，易于推广[12-14]。本文采用高效液相色谱法对土壤中的烷基酚进行测定。用乙腈提取，PEP固相萃取小柱净化，经Zorbax Eclipse Plus C18柱分离，荧光检测器检测，该方法简捷、高效、灵敏度高、准确，满足对土壤中多种烷基酚的定量分析检测要求，为场地环境土壤样品的污染监控提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 标准品及试剂

甲醇和乙腈(色谱级，美国Thermo f isher公司)，10种烷基酚标品：双酚 A(1 000 mg/L)、4-叔丁基苯酚(纯度99.90%)、4-丁基苯酚(纯度99.30%)、4-戊基苯酚(纯度99.74%)、4-己基苯酚(纯度99.70%)、4-叔辛基苯酚(纯度98.65%)、4-庚基苯酚(纯度99.49%)、4-支链壬基酚(纯度99.90%)、4-辛基苯酚(1 000 mg/L)、 4-壬基苯酚(纯度99.72%)(均为有证标准物质，上海安谱实验科技股份有限公司)，正己烷、二氯甲烷(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水(美国Millipore纯水机)，固相萃取柱：填料为苯乙烯和二乙烯苯共聚物(PEP，500 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔公司)，其他未注明的试剂均为分析纯，购自国药。

1.2 仪器设备

Thermo U3000高效液相色谱仪(美国 Thermo f isher 公司)，检测器：可变波长紫外检测器和荧光检测器，色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，粒径为5.0 μm，美国安捷伦公司)，氮吹仪N-EVAP-112 (美国 Organomation 公司)，超声波清洗仪YQ-820C (上海易净超声波仪器有限公司)，离心机TGL-16MS (上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，漩涡混合仪SCRC- M3，电子天平等其他实验室常规设备。

1.3 标准溶液配制

准确称取烷基酚各标准品，用乙腈溶解配制成浓度为1 000 mg/L的烷基酚单标储备液。分别准确吸取适量的烷基酚单标储备液，混匀，用乙腈配制成浓度为1 mg/L的10种烷基酚标准使用液。用乙腈-水混合溶液(体积比为1∶1)将标准使用液稀释成浓度分别为1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L的系列标准溶液。

1.4 样品前处理

准确称取约10 g(精确至0.01 g)的土壤样品，置于事先加入适量硅藻土的50 mL离心管中，充分研磨，使样品呈小颗粒或粉末状，加入10 mL乙腈，涡旋振荡2 min，于超声波清洗机中超声处理20 min，用离心机以4 000 r/min离心3 min，收集萃取液于另外的棕色玻璃样品瓶中。向残渣中再加入10 mL乙腈，涡旋振荡2 min，按上述步骤重复提取2次，合并3次萃取液，用超纯水稀释至200 mL，用0.45 μm滤膜抽滤，待净化。

净化：PEP固相萃取柱经10 mL正己烷、10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇和10 mL实验用水活化后，将过滤后的萃取液全部转移至固相萃取柱上，流速控制在3～5 mL/min。再用10 mL甲醇淋洗，利用负压抽干小柱，用2 mL甲醇和5 mL二氯甲烷洗脱，流速为2～4 mL/min，收集洗脱液于离心管中。

浓缩：将洗脱液于40℃下缓慢浓缩至1.0 mL 以下，加入3 mL乙腈，再浓缩至1.0 mL以下，反复操作2次，此时溶剂被置换为乙腈，用乙腈定容至1.0 mL，涡旋振荡1 min，过0.22 μm有机微孔滤膜于2 mL进样瓶中，4 ℃保存供上机分析。

选用经烘烤过的石英砂代替待测试样，进行空白试验。

1.5 液相色谱参考条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 mm×250 mm，粒径为 5.0 μm)；流动相A：乙腈，流动相B：水；洗脱方式：梯度洗脱，0～15 min，40%～60%A，15～35 min，60%～85%A，保持2 min，37～38 min，85%A～40%A，回到初始流动相后保持6 min；进样体积：20.0 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；荧光检测器波长：激发波长227 nm，发射波长315 nm。

2 结果与讨论

2.1 方法优化

2.1.1 分析检测条件优化

本文分别采用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/1%氨水溶液、乙腈/1%氨水溶液作为流动相，在相同仪器条件下，对目标化合物进行分离检测，根据分离效果确定最佳组合。结果发现，甲醇和酚类间形成氢键后会导致峰型拖尾，为了消除拖尾现象，可在流动相中加入适量碱，但是加入碱会干扰部分目标化合物的分离效果，而采用乙腈/水为流动相时各目标化合物的峰型均尖锐对称。所以本方法选择乙腈和水作为流动相。

本方法以乙腈和水为流动相，采用Zorbax Eclipse Plus C18(4.60 mm×250 mm，粒径为5.0 μm)色谱柱进行梯度优化，通过不断调整流动相的比例及其变化速率，使得10种烷基酚化合物的色谱峰彼此分离，得到最佳梯度洗脱程序。此外，由于土壤样品基质复杂，基质效应大，初始流动相比例设置为乙腈∶水(40∶60)，流速为1.0 mL/min，可降低基质对双酚A的干扰。本方法可在40 min内分离土壤中10种烷基酚类物质，峰型尖锐，分离效果良好。优化后的10种烷基酚类化合物的标准谱图如图1所示。

图1 10种烷基酚类化合物标准色谱图(质量浓度为20 μg/L)

2.1.2 提取条件优化

准确称取10.0 g土壤空白样品，用标准溶液(1.3)加标后制备成浓度为10 μg/kg的土壤空白加标样品，分别采用乙腈和甲醇进行超声萃取，其他处理步骤同1.4，在相同的色谱条件下检测，对比两者的提取效果。结果显示，用乙腈超声萃取时，双酚A、4-叔丁基苯酚、4-丁基苯酚、4-戊基苯酚、4-己基苯酚、4-叔辛基苯酚、4-庚基苯酚、4-支链壬基酚、4-辛基苯酚、4-壬基苯酚的平均回收率分别为92.7%、78.2%、95.9%、96.0%、94.2%、94.5%、95.0%、97.8%、95.5%、94.3%，用甲醇超声萃取时，双酚A、4-叔丁基苯酚、4-丁基苯酚、4-戊基苯酚、4-己基苯酚、4-叔辛基苯酚、4-庚基苯酚、4-支链壬基酚、4-辛基苯酚、4-壬基苯酚的平均回收率分别为90.1%、80.7%、91.8%、96.0%、92.5%、90.2%、87.1%、85.1%、97.9%、82.7%。由此可见，用乙腈超声萃取时大部分化合物的提取效率略优于甲醇，因此选择乙腈作为提取溶剂。制备4份浓度为10 μg/kg的土壤空白加标样，用乙腈作为提取溶剂，研究不同超声处理时间(10 min、20 min、40 min、60 min)对提取效率的影响。结果表明超声处理时间对目标化合物的提取效率基本没有影响，回收率均达85%以上。

2.2 标准曲线与检出限

取1.3中系列标准溶液，按浓度由低到高的顺序用上述色谱条件(1.5)依次进样测定，以烷基酚类化合物各组分的峰面积为纵坐标Y，以其系列浓度为横坐标X，建立标准曲线。如表1所示，在1～100 μg/L线性范围内，线性关系良好，相关系数均达到0.995以上。称取10.0 g土壤空白样品，加入标准溶液得到浓度值为0.1 μg/kg的样品7份，经前处理后测定7次，每次进样量为20.0 μL，按公式(1)计算方法检出限MDL：

表1 线性回归参数和检出限

式中：n为试样的测定次数；t为自由度为n-1，置信度为99%时的t分布(单侧)；S为n次平行测定的标准偏差。

其中当n=7，置信度为99%时，t=3.143。

结果表明本方法的检出限为0.2～0.5 μg/kg，测定下限为0.8～2.0 μg/kg。

2.3 精密度和准确度

准确称取10.0 g土壤空白样品，用标准溶液加标，加标浓度分别为1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg，每个浓度设置6个平行，经提取、净化浓缩后，上机测试，计算6次平行测定的相对标准偏差(RSD)和回收率。结果表明，在1～100 μg/kg范围内，10种烷基酚类化合物的相对标准偏差范围在0.152%～2.870%之间，回收率范围在74.0%～101.0%之间，如表2所示。该方法的精密度和回收率良好。

表2 土壤中10种烷基酚类化合物的精密度和平均回收率(n=6)

2.4 样品定量分析

采集某企业场地6个不同区域的表层(0.5 m)、中层(1.0 m)、深层(2.0 m)土壤样品，共18批，用本方法进行定量分析。结果表明，烷基酚有检出，其中辛基酚含 量为7.96～143 μg/kg，双 酚A含量为0.92～229 μg/kg，其他化合物的含量较低，或者没有检出。本方法灵敏度高，检出限低，稳定性好，适用于土壤中烷基酚类残留量的测定。

3 结语

本文采用高效液相色谱法对土壤中烷基酚类化合物进行分离测定。采用乙腈超声萃取，PEP固相萃取小柱净化，Zorbax Eclipse Plus C 18柱分离，荧光检测器检测，10种烷基酚类化合物峰型尖锐，分离效果良好，精密度和回收率良好，且采用荧光检测器检测，较紫外检测器灵敏度高，可获得较低的检出限，10种烷基酚的检出限达到0.2～0.5 μg/kg。该方法灵敏度高，准确，高效，满足对土壤中烷基酚类化合物的定性定量检测要求，为土壤中烷基酚监测提供参考。