胶东某医院西弗射盾子囊霉近10年检出与药敏分析

郑娟娟,刁玮，田婷婷,王喆,王宏伟,李静,

(青岛大学,山东 青岛 266071 1 医学部医学检验系； 2 附属医院检验科)

西弗射盾子囊霉(Stephanoascusciferrii)最早由KREGER-VAN RIJ[1]在1965年报道，曾用名西弗念珠菌(Candidaciferrii)、类西弗念珠菌(Candidaallociferrii)和西弗毛滴虫(Trichomonascusciferrii)，属于子囊菌类酵母。子囊菌的形态特征差别很大，其共同特征是有性生殖形成子囊孢子，是一类非常少见的机会致病性真菌[2-3]。目前，国内外在病人指甲、痰液、脑脊液、腹膜透析液、外耳道分泌物和血液标本中均有西弗射盾子囊霉的检出报道，在猫耳分泌物、六堡茶中也有分离成功的报道[4-7]。青岛大学附属医院近10年共检出西弗射盾子囊霉8株。本文从临床特点、形态学、培养特性及药敏试验结果等方面对8株西弗射盾子囊霉进行分析，以期为临床少见病原菌感染检出和用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2011年1月—2021年1月，青岛大学附属医院共检出西弗射盾子囊霉阳性病人8例。男性3例，女性5例；年龄35～64岁，其中年龄41～64岁者7例。2011—2015年检出2例，2016—2021年检出6例。标本来自血液内科1例，耳鼻喉科6例，眼科1例；标本类型为血液1例，耳分泌物6例，眼分泌物1例。其中1例病人诊断为急性淋巴细胞白血病(M2型)，住院期间有反复发热症状，血培养检出西弗射盾子囊霉；1例病人因“左眼疼痛伴流泪、视物不清”就诊，眼拭子培养出西弗射盾子囊霉；6例病人因“外耳流脓”入院，耳分泌物培养检出西弗射盾子囊霉。8例病人均根据药敏结果给予抗感染治疗和对症治疗，出院3个月后随访，症状好转，未见明显并发症。

1.2 试剂与仪器

所用MH平板(Mueller-Hinton agar plate)、血琼脂平板、科玛嘉显色平板以及沙保弱培养基平板，VITEK 2 Compact梅里埃全自动细菌鉴定药敏系统及酵母菌鉴定卡(YST)，ATB Fungus 3真菌药敏试剂条、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱VITEK MS、比浊仪DensiCHEK Plus，均为法国生物梅里埃公司产品。

1.3 菌种鉴定与药敏试验

严格按照细菌培养标准化操作规程对送检标本进行处理和常规培养，将标本分别接种于MH平板和血琼脂平板，培养24 h后观察菌落生长状态。取菌落涂片后进行革兰染色显微镜检，高倍镜(1 000倍)下观察。选单菌落转种科玛嘉显色平板及沙保弱培养基平板，分别置35 ℃及28 ℃培养，24 h后观察菌落形态，并涂片进行革兰染色镜检。按操作规程配制2.0浊度的菌液，用VITEK 2 Compact配套酵母菌鉴定卡(YST)进行菌种鉴定，另外取菌涂布VITEK MS靶板进行质谱仪鉴定；同时用ATB Fungus 3酵母菌药敏测试条，对菌液进行体外药敏试验，按说明书操作。

2 结 果

2.1 菌落特征

菌落在MH平板、血琼脂平板、科玛嘉显色平板、沙保弱培养基平板中均能生长，且在28 ℃和35 ℃条件下均生长良好。血琼脂平板35 ℃培养24 h后可见表面光滑呈乳白色的圆形小菌落，在培养3 d后，菌落呈镶嵌生长，质地硬，不易研碎(图1A)；沙保弱培养基平板28 ℃培养1周，菌落呈淡黄色，中心呈菜花状，边缘有粗糙褶皱的大菌落；科玛嘉显色平板培养24 h，可见圆形光滑蓝色小菌落，延长培养时间，边缘逐渐变白，呈现中心蓝色、边缘白色的“小蘑菇”状，继续培养，菌落开始变粗糙，边缘不整并出现脑回状沟槽(图1B)。28 ℃条件下较35 ℃生长缓慢，菌落形态较小。

A：血琼脂平板35 ℃培养3 d；B：科玛嘉显色平板35 ℃培养4 d。

2.2 革兰染色检查

菌落涂片革兰染色镜检，可见革兰阳性酵母样孢子及细长菌丝，孢子为单细胞、卵圆形、沿菌丝排列生长(图2A、B)。

A：血琼脂平板35 ℃培养3 d；B：血琼脂平板35 ℃培养5 d。1 000倍。

2.3 质谱检测

取血琼脂平板上的单个菌落涂布于VITEK MS靶板上，加入0.5 μL甲酸，自然干燥后再加入1.0 μL基质液(4-羟基-2-甲基肉桂酸)，自然干燥后采用VITEK MS仪进行该菌的蛋白指纹图谱检测，结果鉴定为西氟射盾子囊霉，置信度为99.9%。并重复实验，重复鉴定符合率100%。

2.4 VITEK 2 Compact酵母菌鉴定卡(YST)鉴定

按仪器的标准操作规程操作和判定结果。取血琼脂平板上的单个菌落配制2.0浊度的菌液，放入VITEK2 Compact酵母菌鉴定卡，然后置VITEK 2 Compact中，经18～22 h鉴定结果为西氟射盾子囊霉，准确度99.9%。

2.5 药敏试验

按标准操作规程用ATB Fungus 3酵母菌药敏测试条检测8株菌对常见抗真菌药物的敏感性，结果以最低抑菌浓度(MIC)表示，其药物敏感率分别为伏立康唑(MIC≤1.0 mg/L)100%，两性霉素B(MIC≤0.5 mg/L)86%，氟康唑(MIC≤64.0 mg/L)38%，5-氟胞嘧啶(MIC≤32.0 mg/L)43%，伊曲康唑(MIC≤2.0 mg/L)12%。

3 讨 论

本文总结分析了青岛大学附属医院近10年西弗射盾子囊霉的检出情况，作为临床罕见机会致病菌，其检出率近年有增加趋势。分析原因可能与以下几点有关。①肿瘤、血液病等疾病发生率的增高和移植、抗生素、糖皮质激素等治疗手段的大量使用，损伤机体屏障和免疫力，使机会致病性真菌感染率明显增加。从国内外文献报道可以看出，合并西弗射盾子囊霉感染的病人，其临床病程长短不一，但在高龄、恶性肿瘤及服用免疫抑制剂等免疫力低下病人中检出率更高[5,8-9]。②临床对真菌感染的关注度增高，增加了样品送检，提高了检出率。③实验室真菌检测技术手段的发展提高了检出率。分析本研究中的6例慢性中耳炎病人，结合张继东等[10]和贺文芳等[11]报道的病例，我们发现西弗射盾子囊霉相关慢性化脓性中耳炎主要临床表现为外耳道奇痒，常搔刮至皮肤破损后方可解痒，以致出现耳道流脓，脓液呈黄色，稀薄略带臭味，多伴耳鸣，治疗不及时可导致鼓膜穿孔引起听力下降。对于合并西弗射盾子囊霉感染的中耳炎，外科手术可取得比较理想的治疗效果。

西弗射盾子囊霉在MH平板、血琼脂平板和沙保弱培养基平板等临床常用培养基上均可生长，且在28 ℃和35 ℃均生长较好。特征最明显的是，该菌在科玛嘉念珠菌显色培养基上呈现中心蓝色、边缘白色的脑回状菌落，易于观察。根据菌落形态及对该菌镜检可以初步判断病人为真菌感染，结合文献报道西弗射盾子囊霉可同化利用大多数碳水化合物和氨基酸等的生化反应特性，可与其他真菌进行鉴别[12-13]。这有利于进一步的真菌鉴定和抗真菌药物的药敏试验，为临床治疗争取时间和提供药敏依据。有条件的医院还可以用现代分子检测技术快速鉴别该真菌。

国外学者PFALLER等[14]的一项持续10年的关于念珠菌属对氟康唑和伏立康唑药物敏感性监测的研究显示，分离出的西弗射盾子囊霉对氟康唑的敏感率为50%，对伏立康唑的敏感率为50%。SOKI等[15]分离出对氟康唑耐药的菌株。本文西弗射盾子囊霉的药敏情况为，伏立康唑敏感率最高，其次是两性霉素B，伊曲康唑敏感率最低。因此，临床用药时在排除用药禁忌后，可优先考虑伏立康唑，为临床有效治疗争取时间。真菌耐药机制主要为膜通透性降低使细胞内药物浓度降低，药物作用靶酶增多、缺失或者结构改变以及细胞壁合成障碍等[16]。本研究中2015年检出菌株对氟康唑敏感，2020年检出菌株则出现耐药，是否与培养过程有关或基因突变引起尚需深入研究。

总而言之，西弗射盾子囊霉是一种非常少见的机会致病性真菌，主要见于免疫力低下病人，在中青年及免疫力正常人群中偶见合并感染[17-18]。因此，对于就诊病人，应详细询问病史、服药史，对于发热原因不明病人，应做分泌物培养、血培养甚至骨髓培养，必要时可联系实验室延长培养时间。另外，临床实验室应加强对该菌的认识，及时准确地分离鉴定该菌，并积极开展抗真菌药物的敏感试验，以便为临床医师早期合理选择抗真菌药物提供参考，从而有助于正确治疗和有效控制真菌感染，减少耐药菌株的产生。