ZEB1、miR-200、VEGF在复发性流产患者绒毛组织中的表达及意义*

谢诚芳, 胡炼, 彭飞辉, 徐艳

长沙市第四医院妇产科(湖南长沙 410006)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指发生3次或3次以上的自然流产，从流行病学资料中显示，孕育期女性发生RSA的比例大约在1%～5%之间，因此伴随流产次数的增加，RSA的发生率也在提升。RSA的病因有很多种，包括生殖异常、免疫功能障碍、母体系统性疾病、环境因素及胎儿染色体异常等[1-2]。位于10号染色体的基因ZEB1会通过两面激酶(Janus Kinase，JAK)来抑制蛋白的表达，进而参与上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)目前已证实，ZEB1在肾癌、肺癌等浸润转移过程中有表达上调的作用，而ZEB1在胚胎停育中的作用机制目前还没有详尽研究[3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)属于重要的调控因子，其会参与胎盘血管新生的全过程，会促进血管的新生[4]。miR-200则是已知和胚胎着床相关的miR，对绒毛组织中滋养细胞的侵入、增殖及血管新生具有重要调控作用[5]。鉴于此，本研究从比较RSA患者和正常人工流产妇女、早晚期RSA患者绒毛组织中ZEB1、miR-200、VEGF表达量的水平入手，结合ZEB1、miR-200、VEGF相关性分析来验证这3种因子在RSA发生中的预测作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院于2019年1月至2021年1月妇产科门诊接诊的100例RSA患者，将其设置为观察组，同时，挑选出另外100例同期正常妊娠、要求人工终止妊娠的妇女，将其设置为对照组。一般资料对比如表1所示，两组受试者年龄、早期妊娠例数、晚期妊娠例数、早期妊娠周数、晚期妊娠周数、体质指数(BMI)、收缩压、舒张压对比，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。两组受试者妊娠次数对比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组一般资料对比

纳入标准：对照组患者：人工流产的正常妊娠女性；既往无自然流产史；无阴道流血等先兆流产症状；彩超检查胚胎发育正常，有心管搏动和胚芽。观察组患者：患者超声检查、白带检查均排除生殖道畸形及生殖道感染；3次或3次以上自然流产史；夫妻双方、彩超检查胚胎染色体检查正常；患者自身抗体(抗甲状腺抗体、抗核抗体、抗心磷脂抗体等)均呈阴性；彩超提示宫内妊娠，无心管搏动或无胚芽；男方精液检查正常。妊娠周数<12周为早期RSA，12<妊娠周数<28为晚期RSA。

排除标准：甲状腺、凝血功能异常；近期生活中发生重大事件；TORCH检测结果示近期感染；近期接触过重金属等毒物。

本研究已经我院医学伦理委员会批准(CSSDSYY-LLSC-KYXM-2021-4-3)，所有参与本次研究的研究对象均知情同意。

1.2 方法 样品采集及保存：所有孕妇均行清宫术，采集妊娠周数<12周与>12周患者新鲜胎盘绒毛组织100 mg，用无菌水进行冲洗，然后置于液氮中速冻，-80℃保存。另外于入组3 d后清晨空腹抽取所有研究对象静脉血3 mL，高速离心后取上清液，置于-80℃保存待测。

采用miRNA荧光定量PCR法检测胎盘绒毛组织与血清中各自ZEB1、miR-200、VEGF表达量，首先利用各自试剂盒对VEGF、miR-200进行扩增，软件自动生成扩增循环曲线及循环阈值(Ct)，根据公式2-ΔΔCt以U6、β-actin分别为内参计算miR-200、VEGF的相对表达量。miR-200引物序列为F：5′-CGGGTGAAATGTTTAGG-3′，R：5′-TTGGCCATGTGTACGTA-3′。ZEB1引物序列为F：5′-GCACCTGAAGAGGACCAGAG-3′；R：5′-TGCATCTGGTGTTCCATTTT-3′。VEGF引物序列为F：AGGCCAGCACATAGGAGAGA，R：TACCGGGATTTCTTGCGCTT。试剂盒由杭州开泰生物技术有限公司(生产批号：2936441570、18512004752)提供。

2 结果

2.1 ZEB1、miR-200、VEGF在两组胎盘绒毛组织中、血清中的表达差异 观察组绒毛组织中、血清中miR-200表达量明显比对照组高(P<0.05)，ZEB1、VEGF表达量明显比对照组低(P<0.05)。见表2、3和图1。

表2 ZEB1、miR-200、VEGF在两组胎盘绒毛组织中的表达

表3 ZEB1、miR-200、VEGF在两组血清中的表达

图1 ZEB1、miR-200、VEGF在两组胎盘绒毛组织和血清中的表达PCR条带图

2.2 ZEB1、miR-200、VEGF在早期、晚期患者胎盘绒毛组织中、血清中的表达差异 与对照组早期流产患者相比，对照组晚期流产患者绒毛组织中、血清中ZEB1表达量升高，miR-200、VEGF表达量降低、观察组早期RSA、晚期RSA患者绒毛组织中、血清中miR-200表达量升高，ZEB1、VEGF表达量明显降低(P<0.05)。与对照组晚期流产患者相比，观察组早期RSA、晚期RSA患者绒毛组织中、血清中miR-200表达量升高，ZEB1、VEGF表达量明显降低(P<0.05)。与观察组早期RSA患者相比，晚期RSA患者绒毛组织中、血清中miR-200表达量降低，ZEB1、VEGF表达量升高(P<0.05)，见表4、5。

表4 ZEB1、miR-200、VEGF在早期、晚期患者胎盘绒毛组织中的表达

表5 ZEB1、miR-200、VEGF在早期、晚期患者血液中的表达

2.3 绒毛组织中ZEB1、miR-200、VEGF三者之间的相关性 相关性分析显示，ZEB1、miR-200呈负相关(r=-0.349，P=0.004)；miR-200、VEGF呈负相关(r=-0.486，P=0.001)；ZEB1、VEGF呈正相关(r=0.654，P=0.001)。见图2。

图2 ZEB1、miR-200、VEGF之间相关性

2.4 ROC曲线分析ZEB1、miR-200、VEGF对RSA的诊断价值 如表6、图3所示，ROC曲线分析显示，与ZEB1、miR-200、VEGF单项诊断相比，三项联合对RSA诊断价值较高(P<0.05)。

表6 ROC曲线分析ZEB1、miR-200、VEGF对RSA的诊断价值

图3 ZEB1、miR-200、VEGF对RSA的诊断价值ROC曲线

3 讨论

RSA属于较为常见的妇科妊娠类疾病，其会对女性的生理、心理造成严重影响，RSA在妊娠早期、晚期都会出现，严重者会发展成为不孕不育[6]。导致RSA的因素有很多，其中最常见的因素包括遗传因素、环境因素及胚胎发育因素等，虽然该疾病的作用机制目前还未明确，但可以肯定的是发生RSA的直接原因是子宫内膜得不到充足的营养供给。在整个妊娠环节中，胎盘绒毛组织血管会持续控制滋养层细胞运动，一旦滋养层细胞的作用机制被干扰、阻断，其最终结果就会引发RSA[7-8]。

相关研究显示，ZEB1在细胞分化、基因调控及胚胎发育中一直发挥重要作用。在胚胎发育阶段，胚胎的着床及形成都需要ZEB1的参与，ZEB1低表达则会阻碍上皮间质转化，让细胞浸润能力降低，此时滋养层外胚胎细胞利用上皮间质转化进行迁移的过程就会受到影响，最终会阻断胚胎和母体之间联系的建立。由此可以看出，ZEB1在母胎物质交换的作用是至关重要的[9-10]。由此可知，ZEB1发挥自身调控作用会直接决定妊娠结局的如何，本研究结果显示，和人工流产患者相比，RSA患者绒毛组织中、血清中的ZEB1表达水平都较低，且从RSA不同分期看，早期患者ZEB1表达水平也远低于晚期患者。由此可以推断，ZEB1自身的调控作用对妊娠结局是有一定影响的，ZEB1低表达会让滋养层细胞浸润能力降低，上皮间质转化受到抑制，导致胎盘浅着床，发生RSA的概率会大大增加。

miRNA表达和RSA存在关联，miR-200多分布在上皮组织中，在上皮间质转化中发挥调节作用，研究表明，miR-200会调节滋养细胞[11-12]。另外，以往研究证实，在RSA患者绒毛组织中、血清中miR-200的表达量会异常升高，miR-200表达异常升高后让子宫内膜受容性降低[13-14]。在本研究结果中，和人工流产患者相比，miR-200在RSA患者绒毛组织中、血清中的表达量都较高，此结果与上述研究结果一致，另外，从RSA病理分期看，早期RSA患者miR-200的表达量也高于晚期RSA患者。提示RSA患者血液及绒毛组织中miR-200的过高表达会阻碍上皮间质转化，影响胚胎发育。

在胚胎发育中，VEGF会让血管形成高特异有丝分裂原，让血管通透性增加，对血管增生及内破细胞分化过程有重要影响[15-16]。有研究指出，VEGF的低表达是胚胎血管障碍的直接原因[17-18]。研究证实，在妊娠阶段，孕妇子宫内膜及绒毛组织间隙中的氧分压较低，胚胎会长时间处于低氧环境中[19-20]，而VEGF高水平表达会促进分支血管的生成，保证血管的重铸，为胚胎提供有效的血氧供给[21]。本研究结果显示，和人工流产患者相比，RSA患者绒毛组织中、血清中VEGF的表达量较低，且在RSA不同分期中，早期RSA患者VEGF的表达量要低于晚期RSA患者。这说明在胚胎早期发育阶段，VEGF的过低表达不利于胚胎血管的生长、分化，一旦分支血管的生成与重铸无法完成，母体对胚胎的营养供给就无法进行，则胚胎会停止发育。

另外本文分析ZEB1、miR-200、VEGF之间的相关性发现，三者存在相关关系，是判定RSA发生的重要参考，ZEB1、VEGF与miR-200存在负相关关系，ZEB1和VEGF是正相关关系。滋养层细胞的浸润能力下降，上皮间质转化能力降低，不利于分支血管的生成，因此胚胎的着床和发育均受到影响，最终发生RSA。而影响上述机制的正是ZEB1的低表达、miR-200的高表达、以及VEGF的低表达，采用ROC曲线分析三者对RSA的诊断价值发现，三者联合用于诊断RSA的价值较高，但本文并未深入分析ZEB1、miR-200、VEGF作用于RSA的具体机制，因此，本文研究结果未来还需要更多的临床数据来证实以验证三者与RSA的关系。

综上所述，RSA患者绒毛细胞组织中、血清中ZEB1、VEGF表达会异常降低，miR-200表达会异常升高，且RSA发生的越早，可对患者体内ZEB1、VEGF、miR-200水平造成影响，RSA的发生与ZEB1、miR-200、VEGF有直接关系，所以绒毛组织中三者表达之间存在相关性，联合诊断可以预估RSA的发生。

利益相关声明：本文所有作者声明没有利益冲突。

作者贡献说明：谢诚芳直接参与酝酿和设计实验，实施研究，采集分析解释数据，撰写论文，获取研究经费，全面支持该项研究，审阅论文，指导研究。胡炼审阅论文，指导研究。彭飞辉审阅论文。徐艳采集分析解释数据，审阅论文。