高温胁迫下芽孢杆菌对条斑紫菜生长及生理的影响

欧阳乐飞，王林华，邓高威，张庆起，高焕,2,4，阎斌伦,2,4

（1.江苏海洋大学，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室，江苏 连云港 222005；2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005；3.连云港赣榆佳信水产开发有限公司，江苏 连云港 222100；4.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

冷温性、雌雄同株的条斑紫菜Pyropia yezoensis味道鲜美，营养成分丰富，对人体具有很高的食用和药用价值[1]，是我国长江以北沿海地区重要的海藻栽培种之一[2]。近年来，全球紫菜种质日趋枯竭以及国内紫菜消费快速增长，推动了我国紫菜养殖方式的多样化，促进了紫菜养殖产业的可持续发展。

藻际微生物种类多且功能复杂，其中益生菌分泌维生素、生长素等可促进藻体生长[3,4]，但是，在无机盐缺乏时，藻际微生物与藻类共同竞争营养物质，抑制藻体生长[5]。近两年紫菜养殖范围不合理扩大、工业发展、气候环境变化，海区环境逐渐恶化，每年都有不同程度的烂菜发生。引起紫菜病害发生的原因主要有两方面，一是病原菌侵染等生物因素，如假单胞菌属（Pseudomonas）、海科贝特菌（Cobetia marina）引起紫菜叶状体细菌性红烂病，绿斑病等[6,7]；另一方面，高温、低盐等物理环境因子的变化导致紫菜生理代谢紊乱，也可造成烂菜现象。陈玉婷[8]研究表明，高温等理化胁迫会破坏紫菜内膜系统，改变膜透性，加剧藻体活性氧上升，损伤各类机体。而藻体会上调氧化酶活性和丙二醛（MDA）及游离脯氨酸（Pro）等渗透调节物质的含量来修复机体[9,10]，但是胁迫程度过高、时间较长，超过了藻类的自我修复能力则会迅速腐烂。

芽孢杆菌（Bacillus sp.）能够产生抵抗特殊不利条件的芽孢，也是公认的水产养殖益生菌[11]。方文雅等[12]在温州紫菜养殖区分离的芽孢杆菌，抑菌活性较强，可能在藻际微环境中具有调节作用。前期研究表明，藻际细菌Bacillus sp.LPyS1 在15℃可促进条斑紫菜生长，提高总蛋白含量，对条斑紫菜抗氧化酶（超氧化物岐化酶SOD 和过氧化物酶POD）活性和脯氨酸Pro 的含量影响极小，是一株益生菌（另文发表）。本文通过研究22℃高温胁迫下芽孢杆菌Bacillus sp.LPyS1 对条斑紫菜生长及生理的影响，以阐明Bacillus sp.LPyS1 为代表的藻际微生物在高温下的功能变化及其生理作用，并为减少紫菜病害发生提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 条斑紫菜叶状体

实验用条斑紫菜叶状体在2019 年12 月10 日采于连云港市赣榆区海头镇条斑紫菜养殖海区，洗净晾干后，-20℃密封保存。实验前取出样品，于灭菌海水中复苏24 h，挑选外观特征上一致的红褐色叶片，剪成1 cm2的小块状，依次用灭菌海水清洗3次、0.7%KI 溶液中浸泡10 min、再用灭菌海水清洗3 次。条斑紫菜复苏培养后，对紫菜叶状体进行无菌处理，处理方法参考[13]，之后放入0.1%（W/V）的氨苄青霉素溶液中浸泡10 min，之后在组合抗生素（300 μg/mL 氨苄青霉素、100 μg/mL 卡那霉素、100 μg/mL 庆大霉素）中浸泡10 h 以上。用灭菌海水清洗3 次以上，将条斑紫菜叶片置于新鲜紫菜培养基（营养母液：100 g/L KNO3、10 g/L KH2PO4、2.5 g/L Fe-SO4、0.25 g/L MnSO4和20 g/L EDTA-Na2，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，使用时与灭菌海水以1∶1 000配制成营养海水）培养2 d 备用。培养条件：温度15℃，盐度30，光强3 500 lx，光周期12L∶12D，每24 h 更换1 次紫菜培养基，充气。

1.1.2 芽孢杆菌

Bacillus sp.LPyS1 由本实验室分离自条斑紫菜叶状体表面，甘油管-80℃冻存。2019 年12 月10日从连云港海头镇紫菜养殖区采集海水与条斑紫菜，经梯度稀释后将紫菜振荡液涂布于Zobell 2216E 海水培养基（酵母粉1 g，蛋白胨5 g，柠檬酸铁0.1 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.6～8.0）中，37℃倒置培养24 h，按细菌菌落形态特征挑取不同单菌落，分区划线3 次，显微镜下镜检后接种于甘油管-80℃保种。分离细菌统一编号（L 表示江苏连云港，Py 表示条斑紫菜，S 表示振荡法，相同处理方式获得的不同菌株用数字1、2、3 表示，以此类推。如LPyS1 表示连云港条斑紫菜振荡处理获得的1 号细菌。37℃140 r/min 过夜活化培养。扩大培养与活化培养条件一致，24 h 后离心去除培养液。沉淀清洗离心后，用条斑紫菜培养液调整细胞浓度约1×106cells/mL 备用。

1.2 方法

300 mL 紫菜培养基中接种0.2 g 无菌处理过的条斑紫菜叶状体与约3×106cells/mL Bacillus sp.LPyS1，在温度22℃、盐度30、光强3 500 lx、光周期12L∶12D 和充气条件下培养。在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 取样，测定其相对生长率（RGR）、可溶性蛋白（soluble protein）、藻胆蛋白（phycobiliprotein）、Pro 和丙二醛（MDA）的含量，以及超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性。以仅接种条斑紫菜叶状体培养作为对照，培养条件与共培养组相同。

相对生长率（RGR）按照公式[14]：RGR（%/d）=（lnMt-lnM0）/t×100 计算；式中，M0为藻体的初始质量（g），Mt为培养至第t 天时藻体的鲜重，称量前用吸水纸将藻体表面培养液完全吸干；采用南京建成生物科技公司T-SOD 试剂盒（A001-1，羟胺法）和POD 测定试剂盒（A084-3，比色法）测定酶活；采用南京建成生物科技公司试剂盒（A003-3-1，微板法）测定MDA 含量；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法[15]测定；采用南京建成生物科技公司试剂盒（A107-1-1，酸性茚三酮法）测定Pro 含量；参考高洪峰[16]的方法测定藻胆蛋白含量。各实验设置3 个平行4 次重复。

1.3 数据统计分析

实验数据采用Origin 2018 和SPSS 25.0 统计软件进行数据处理及统计分析，以P<0.05 表示显著性差异，P<0.01 表示极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 高温下芽孢杆菌对条斑紫菜生长的影响

22℃高温胁迫下芽孢杆菌对条斑紫菜生长的影响见图1。实验期间，对照组条斑紫菜的RGR 呈上升趋势，生物量持续增加；藻菌共培养组RGR 先上升后下降，在24～48 h 显著高于对照组（P<0.05），72 h 低于对照组，但差异不显著（P>0.05）。培养4 d后，藻菌共培养组与对照组紫菜叶状体颜色均变淡，开始出现烂菜现象，两组培养体系逐渐变浑浊，其中共培养组腐烂程度高于对照组。

2.2 高温下芽孢杆菌对条斑紫菜蛋白合成的影响

两组条斑紫菜的RPE（A1）、RPC（A2）和APC（A3）3 种色素蛋白含量的整体变化相似，共培养组的3 种藻胆蛋白含量在6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h时均显著高于对照组（P<0.05），12 h 达最大值。共培养组的藻胆蛋白含量RPE 为6.7 mg/g，RPC 为5.7 mg/g，APC 为4.1 mg/g；对照组藻胆蛋白含量中RPE为5.1 mg/g，RPC 为4.8 mg/g，APC 为2.9 mg/g（图2）。但是，在24 h 时共培养组藻胆蛋白含量均显著低于对照组（P<0.05），表明芽孢杆菌一定程度上促进了条斑紫菜的藻胆蛋白合成与积累。

2.3 高温下芽孢杆菌对条斑紫菜抗氧化性的影响

22℃高温胁迫下芽孢杆菌对条斑紫菜抗氧化指标的影响主要体现在SOD、POD 酶活性及MDA含量的变化。图3-B1所示，藻菌共培养组和对照组SOD 酶活性均呈现先上升后下降的趋势，在24 h 时达最高，分别为631.36 U/g 组织湿重和573.71 U/g组织湿重，且差异显著（P<0.05），在0 h 与72 h 差异不显著（P＞0.05）。

图3-B2表明，共培养组和对照组POD 酶活性也呈先上升后下降再上升的趋势，24 h 时POD 酶活性显著上升（P<0.05）至最高，分别为31.19 U/mg 和11.33 U/mg，72 h 时二者又显著上升（P<0.05），但共培养组酶活性仍高于对照组。

如图3-B3表明，藻菌共培养组和对照组的MDA 含量均呈先上升后下降再上升的趋势，在6 h达最高值，分别为141.97 nmol/g 和118.47 nmol/g，共培养组在6 h、12 h 和72 h 显著高于对照组（P<0.05）。以上结果表明，高温胁迫下两组紫菜均受到了不同程度的氧化胁迫，且藻菌共培养组受到了较大的活性氧胁迫。

2.4 高温下芽孢杆菌对条斑紫菜渗透性的影响

22℃高温胁迫下，芽孢杆菌对条斑紫菜渗透指标的影响主要体现在可溶性蛋白、Pro 以及藻胆蛋白含量的变化上。由图4-C1可知，藻菌共培养组和对照组可溶性蛋白含量均呈先上升后下降再上升的趋势，共培养组在12 h 达到最高，为19.68 mg/g，显著高于对照组（P<0.05）；在24 h 与48 h 显著低于对照组（P<0.05），24 h 达到最低，为8.22 mg/g；在0 h、6 h 与72 h 两组无显著性差异（P<0.05）。

从图4-C2可见，对照组Pro 呈现先上升后下降的趋势，12 h 达到最大，为51.87 μg/g；藻菌共培养组Pro 含量在0～6 h 快速上升，随后下降，到24 h 达到最低，为15.39 μg/g，显著低于对照组（P<0.05），从24 h 至72 h 持续上升，72 h 达到实验期内最高，为58.78 μg/g，显著高于对照组（P<0.05）。共培养组与对照组Pro 含量在24 h 达到极大差值，为26.77 μg/g。Pro 与可溶性蛋白都是渗透调节物质，表明共培养组在24 h 后分泌了更多的可溶物质，调节渗透压以适应高温胁迫环境[17]

3 讨论

微生物与温度是影响紫菜生长状况的重要因素[18]。选育生长快、耐高温的优良品系有利于解决目前紫菜种质资源退化问题，而通过益生菌增强紫菜抗逆性、促进紫菜生长，有利于减少紫菜病害频发等问题。杨华田等[19]研究发现：芽孢杆菌对坛紫菜RGR 的影响是前期迅速上升，而后期缓慢降低。张元等[20]发现，高温胁迫下野生型紫菜出现细胞质外溢、逐渐坏死等现象。本研究中，22℃下条斑紫菜RGR 在0～48 h 迅速上升，芽孢杆菌增强了条斑紫菜抗逆性，促进了条斑紫菜RGR 上升，随后藻体颜色变淡，96 h 后出现腐烂现象，对照组的藻体腐烂程度更为剧烈。而牟宗娟[21]研究表明：在22℃海水下条斑紫菜在36 h 开始病烂，这进一步表明芽孢杆菌可增强条斑紫菜的抗逆性。在高温胁迫下，条斑紫菜生长和细胞内部分生理生化指标存在一定的变化规律。王文磊等[22]根据光合参数结果观察到，对紫菜附生菌施加胁迫时，菌体受到显著的影响，但在正常条件下几乎完全恢复，表明菌体对紫菜的抗逆性影响程度与菌体自身状态密切相关。前期实验发现，在15℃下菌株Bacillus sp.LPyS1 对条斑紫菜具有促生长作用，与条斑紫菜形成互利共生的关系，这与熊玉琴等研究结果一致[23]，而在22℃高温下Bacillus sp.LPyS1 对条斑紫菜造成了一定程度的胁迫，表现在48 h 后随着芽孢杆菌对条斑紫菜抗逆性的影响作用逐渐降低，条斑紫菜RGR 缓慢下降。宋丹丹等[24]研究发现，假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.NPyS3 对颗石藻（Erdschreiber）生长的影响远高于非生物因素的影响，由此推测Bacillus sp.LPyS1 可能通过分泌某些代谢产物而增强了条斑紫菜抗逆性，从而影响RGR 变化，高温会影响藻类的生长与生理组分以及细菌的生长和代谢，改变微生物菌群结构[25]，影响条斑紫菜的生长。

高温胁迫使藻体内活性氧含量上升，使不饱和脂肪酸过氧化为MDA，破坏膜结构的完整性[26,27]。本研究结果表明：0～72 h 内，酶抗氧化物（如SOD、POD）和非酶抗氧化分子（如MDA、藻胆蛋白）先上升后下降，这与条斑紫菜RGR 的变化趋势一致，其中0～48 h 芽孢杆菌对条斑紫菜抗逆能力的影响远大于高温胁迫的影响。SOD、POD 活性的变化趋势与Contreras-Porcia 等对P.columbina 的研究结果一致[28]，这表明在实验前期条斑紫菜受到较大的胁迫，但是，RGR 依然处于快速上升状态，说明期间芽孢杆菌极大地增强了条斑紫菜的抗逆性，发挥了益生作用。共培养组MDA 含量在6 h 显著上升达到最高值，为141.97 nmol/g，高于张元所测定耐高温型与野生型坛紫菜MDA 的含量[29]，而后下降并处于相对平稳状态，这指示芽孢杆菌有利于提升条斑紫菜抗逆能力。本研究表明，高温有利于促进条斑紫菜藻胆蛋白合成，这与黄林彬等[30]测定的叶绿素a、藻胆蛋白含量变化结果相同。

藻体为减小细胞损伤，通过调节渗透压来调整，积累脯氨酸、可溶性蛋白等渗透调节物，提升细胞渗透调节能力[31]。与对照组相比，共培养组Pro、可溶性蛋白在12 h、24 h 和48 h 时均具有显著性差异，这与贺亮研究高温胁迫下半叶马尾藻（Sargassum hemiphyllum）的生理响应变化一致[32]，表明芽孢杆菌对条斑紫菜的抗逆性具有重要影响，由此推测高温胁迫下，通过与芽孢杆菌等益生菌的共培养增强条斑紫菜的抗逆性，为条斑紫菜抗高温和高产新品种选育奠定实验基础。前期实验研究表明，24 h是Bacillus sp.LPyS1 对数生长期与形成稳定生物膜的平台期，推测22℃下促使芽孢杆菌在条斑紫菜表面形成了稳定的生物膜，导致条斑紫菜与环境物质交换的难度增加，造成后期条斑紫菜叶状体腐烂。

综上所述，在培养初期，Bacillus sp.LPyS1 能够促进条斑紫菜的生长，但是，随着培养时间的延长，条斑紫菜的抗逆性及益生作用会变化。在与高温的共同作用下，后期出现了腐烂现象，可能是22℃高温下芽孢杆菌对条斑紫菜的抗逆能力随着培养时间的延长逐渐降低；或是22℃高温下芽孢杆菌在条斑紫菜表面快速增殖形成的生物膜影响了藻体与外界进行物质交换，这有待进一步验证。本实验通过建立藻-菌共培养体系为进一步揭示条斑紫菜抗高温变化规律和培育抗高温紫菜新品种提供了一定参考。在高温天气下，应实时了解条斑紫菜养殖海域的微生物群落组成与功能变化，及时发现紫菜养殖水环境中的微生物胁迫隐患，全面合理地预防条斑紫菜病害发生。