大黄鱼免疫球蛋白IgM 鼠源多克隆抗体的制备及其结合特性

何亮银，吴建绍，陈卯森，黄伟卿,3，韩坤煌,3，李进寿,3，史晓丽,3

（1.宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100；2.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；3.闽东水产品精深加工福建省高等学校工程研究中心，福建 宁德 352100）

大黄鱼（Larimichthys crocea）主要分布于中国东海和黄海南部，以及南海雷州半岛东侧近海水域[1]，是我国重要海水经济鱼类。据中国渔业统计年鉴，2019 年大黄鱼养殖产量为225 549 t，已连续多年位居我国海水养殖鱼类之首[2]。近年来，大黄鱼网箱养殖密度过高，水体流通不畅，水体环境日益恶劣，病害严重，较易多发刺激隐核虫病、水霉病、内脏白点病、肠炎病、烂尾病及弧菌病等，给大黄鱼养殖业带来严重的经济损失[3]。有效控制各种病原感染已成为大黄鱼养殖产业健康可持续发展的迫切要求，免疫防治是今后养殖鱼类病害防治的重要发展趋势。为科学实施免疫防治，除了相关免疫制剂的研发外，深入研究鱼体免疫系统的组成及其分子特征也必不可少。

免疫球蛋白是鱼类免疫系统重要组成部分，在获得性免疫中发挥重要作用[4]。近年研究表明，鱼类中存在多种类型免疫球蛋白，已发现的有IgM、IgD和IgT/IgZ，对鱼类免疫球蛋白的结构、理化特性及免疫学功能也有较为全面的研究[5]。IgM 是鱼类中被发现最早的一类免疫球蛋白，主要以膜结合型和分泌型两种形式存在[6]。分泌型IgM 主要以四聚体的形式分布于鱼类血液和黏液中，其中每个IgM 分子由2 条分子量一般为60～81 kDa 的重链和2 条分子量一般为20～30 kDa 的轻链组成[7]。鱼类免疫球蛋白IgM 的纯化方法主要有盐析法、离子交换法、亲和层析法等。张伟等[4]利用饱和硫酸铵盐析结合Protein A 亲和纯化方法获得了高纯度的大菱鲆（Scophthalmus maximus）IgM。目前，对硬骨鱼类的IgM 特性及功能已有许多研究，包括草鱼（Cienoyharyngodoni dellus）[8]、鳜（Siniperca chuatsi）[9]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[10]和斑马鱼（Danio rerio）[11]等。

水产病原疫苗防治病害被广泛认为是一种绿色健康、安全有效的可行途径[12]。一种疫苗研制的方式是将灭活后的病原菌免疫鱼体，收获抗血清作为一抗，以制备的抗宿主鱼体IgM 抗体为二抗，酶标抗体为三抗，以免疫印迹结合串联质谱鉴定免疫原性蛋白，并进一步开发为亚单位疫苗或基因工程疫苗[13,14]。本研究利用盐析结合Protein A 亲和纯化了大黄鱼血清IgM，用SDS-PAGE 分析了纯化IgM 的纯度及分子量，以纯化的IgM 免疫小鼠并获得结合特性良好的抗血清，为后续应用大黄鱼IgM多抗研究鱼体免疫机制和疫苗打下了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

用于血清制备的健康大黄鱼购自宁德富发水产有限公司，体质量300～400 g。用于多克隆抗体制备的Balb/c 小鼠购自吴氏实验动物公司。

1.2 大黄鱼血清的制备

将大黄鱼移至MS-222 浓度为50 mg/mL 的海水中麻醉约30 s 后，用一次性5 mL 注射器尾静脉采血，采集的静脉血于4℃静置过夜后，次日3 000 r/min、4℃离心10 min，取上清液冻存于-20℃备用。

1.3 大黄鱼血清IgM 的分离纯化

1.3.1 大黄鱼血清IgM 的饱和硫酸铵粗提

以等体积的预冷无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）稀释大黄鱼血清后，冰浴下逐滴加入预冷的饱和硫酸铵，并不断搅拌，至溶液中硫酸铵的终浓度为50%后放置4℃过夜，次日12 000 r/min 离心30 min 后，弃上清，以适量0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液重悬沉淀并转移至透析袋中。透析至检测不到SO42-为止，透析液经硝酸硝化后滴加氯化钡溶液，观测是否有硫酸钡白色沉淀生成，以检测SO42-。

1.3.2 大黄鱼血清IgM 的亲和纯化

按照Hitrap Protein A HP 纯化柱（GE）操作步骤，以5 倍柱体积的平衡缓冲液（0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液，pH 7.0）洗涤层析柱。透析液经0.45 μm 滤膜过滤后，上样于层析柱中，孵育30 min 后，以平衡缓冲液将未与层析柱结合的杂蛋白洗脱完全后，再以洗脱液（0.1 mol/L 柠檬酸，pH3.5）将层析柱上的结合蛋白洗脱下来。按洗脱目的蛋白流出液∶收集缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 9.0）=1∶9 的比例将洗脱的目的蛋白保存于收集缓冲液中。

1.4 大黄鱼血清IgM 的浓缩与浓度测定

洗脱蛋白装入透析袋中用超纯水透析48 h，于冷冻干燥机浓缩后，以适量PBS 重悬蛋白样品用于浓度测定。蛋白浓度以改良型Bradford 试剂盒（上海生工）采用酶标法测定：以梯度稀释的BSA 标准蛋白质溶液加入Bradford 工作液后595 nm 吸光值为纵坐标，不同BSA 标准蛋白液浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定透析后的洗脱蛋白加入Bradford工作液后的吸光值，计算其对应的蛋白浓度。以无菌PBS 调整目的蛋白浓度为1 mg/mL，放置于-20℃备用。

1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析IgM 的特性

采用Mini-Protein cell 系统（Bio-Rad），分别配制浓度为12%和5%的聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，用于蛋白分离。经透析后的洗脱蛋白与等体积的上样缓冲液混匀后，沸水中煮沸5 min 后上样，恒压90 V 下电泳至溴酚蓝从分离胶溢散，剥离分离胶进行G250 染色并拍照。

1.6 大黄鱼血清IgM 鼠源多克隆抗体的制备

浓度为1 mg/mL 的IgM 分4 次免疫8～12 周龄的Balb/c 小鼠，具体免疫程序如下：基础免疫，IgM与弗氏完全佐剂1∶1 混匀至“油包水”状态后，腹腔注射0.2 mL；两周后进行第1 次加强免疫，IgM 与弗氏不完全佐剂1∶1 混匀，腹腔注射0.2 mL；第四周和第五周分别再加强免疫一次，尾静脉注射不加佐剂的IgM 蛋白0.2 mL；最后一次加强免疫后一周摘小鼠眼球一次性取血，全血室温倾斜放置2 h 后，于4℃过夜，次日8 000 r/min、4℃离心10 min 获抗血清。

1.7 鼠抗血清抗体效价测定

以0.05 M 碳酸盐缓冲液将IgM 浓度调整至20 μg/mL，按每孔100 μL 加入96 孔酶标版，设置3 个重复，4 ℃包被过夜；次日倒掉包被液，PBST（含0.5%Tween 20 的PBS）洗涤3 次后，加入含5%脱脂奶粉的PBST，37℃孵育1 h；PBST 洗涤三次后，每孔加入PBST 稀释成不同浓度梯度的鼠抗血清100 μL，37℃孵育1 h；按上述步骤洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（sigma，1∶5 000）100 μL，37℃孵育45 min；洗涤后加入TMB 显色液（碧云天）显色至预期深浅后加入2 mol/L H2SO4终止显色，测量酶标仪在450 nm 下反应液吸光值。判定P/N≥2.1 时为阳性。

1.8 大黄鱼IgM 鼠源抗血清结合特性分析

将纯化的大黄鱼血清IgM 经SDS-PAGE 分离后，恒压30 V 下作用90 min 转移到PVDF 膜上，在37℃条件下以含5%脱脂奶粉的PBST 封闭1 h。根据上节测定的抗血清效价，PVDF 膜经PBST 洗涤后置于稀释后的抗血清中，37℃孵育1 h，阴性对照样品置于按相同倍数稀释的健康小鼠血清中孵育。PVDF 膜经清洗后置于以PBST 稀释的辣根过氧化酶酶标记的羊抗鼠IgG（Sigma，1∶5 000）抗体中，37℃孵育45 min，经PBST 洗涤后加入TMB 显色液（碧云天），显色后用超纯水清洗终止反应，拍摄记录反应结果。

2 结果与分析

2.1 大黄鱼血清IgM 的亲和纯化

利用Protein A 亲和层析柱纯化经饱和硫酸铵粗提后的IgM 时，样品可分为两部分：一是未能与层析柱中Protein A 结合的蛋白，直接被平衡缓冲液洗脱下来（图1，峰1）；另一部分是能与层析柱中Protein A 结合的蛋白，被洗脱缓冲液洗脱下来（图1，峰2）。

2.2 SDS-PAGE 分析大黄鱼血清IgM

SDS-PAGE 检测纯化的大黄鱼IgM 纯净度和分子量结果显示，经饱和硫酸铵粗提后的血清样品中除主要成分IgM 外，仍包含较多杂质（图2，泳道1）。利用Protein A 亲和层析柱纯化得到的蛋白样品纯度很高，包含两条主要蛋白条带，比照标准分子量Marker，Quantity One 软件测定这两条带分子量分别约为75 kDa 和28 kDa（图2，泳道2），分别与多数鱼类IgM 的重链和轻链相符合，可判定纯化得到的蛋白为大黄鱼IgM。

2.3 大黄鱼血清IgM 的浓度测定

使用Bradford 试剂盒测定纯化后IgM 浓度，使用BSA 标准品制作标准曲线，得到的拟合方程为y=0.002x+0.419（R2=0.989）（图3）。对纯化IgM 经蒸馏水透析48 h，冷冻干燥后经PBS 重悬，稀释5 倍后测得溶液吸光值为0.956，计算原蛋白液浓度为1.343 mg/mL。

2.4 大黄鱼血清IgM 鼠源多克隆抗体效价测定

分离纯化后的大黄鱼血清IgM 蛋白调整浓度为1 mg·mL-1后免疫Balb/C 小鼠，制备鼠抗大黄鱼血清IgM 血清，用间接ELISA 测定抗血清效价。ELISA 检测结果显示，随着鼠源抗血清稀释倍数增加，P/N 值逐渐降低。当稀释倍数小于20 000 时，P/N>2.1，而当稀释倍数大于30 000 时，P/N<2.1，表明试验制备的鼠抗血清效价较高，达20 000（图4）。

2.5 Western blotting 分析鼠源多克隆抗体结合特性

Western-blotting 分析制备的鼠抗大黄鱼IgM多抗的结合特性结果显示：以健康小鼠代替鼠源抗血清的阴性对照组无显色条带（图5，泳道2），实验组（图5，泳道3）在约75 kDa 和28 kDa 左右出现与大黄鱼血清IgM 的重链和轻链（图5，泳道1）位置一致的条带，由此可以确定，制备的鼠抗血清可以特异性结合大黄鱼血清IgM。

3 讨论

3.1 大黄鱼血清IgM 的纯化

盐析法、凝胶过滤法、亲和层析法及离子交换法等是目前用于分离纯化鱼类免疫球蛋白IgM 的主要方法，多采用一种或多种方法联合达到理想的分离纯化效果。硫酸铵盐析法被广泛用于多种硬骨鱼类血清IgM 的初步分离。该方法可通过简单操作析出大量的血清IgM，对样品进行粗提，但粗提液中除含有高浓度的IgM 外，还包含较多其他杂蛋白，需要进一步纯化[8,15-17]。Protein A 是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的细胞壁组成成分，可以特异性结合免疫球蛋白IgG 和部分IgM 的Fc 段，被广泛应用于亲和纯化鱼类的IgM，并取得理想的纯化效果[18-20]。本研究采用浓度为50%的饱和硫酸铵粗提，结合Protein A 亲和层析纯化了大黄鱼的血清IgM。SDS-PAGE 显示纯化后的IgM 由两条主要蛋白条带组成，分子量分别约为75 kDa 和28 kDa，这与以往报道的大黄鱼血清IgM[16]及其他硬骨鱼类IgM[4,8,15]的重链及轻链分子量大小相符；且纯化的IgM 除重轻链外，不包含其他杂蛋白，表明大黄鱼血清IgM 的纯化效果良好，可用于后续试验动物的免疫。

3.2 IgM 多克隆抗体在水产病害防治中的应用

通过筛选和鉴定水产病原具有保护作用的免疫原性蛋白，研制亚单位疫苗和基因工程疫苗，被广泛应用于防治水产病原侵染。一般做法是，将灭活后的病原按标准免疫流程注射到小鼠、家兔等实验动物体内，免疫周期结束后获取抗血清作为一抗，酶标羊抗鼠或抗兔Ig 为二抗，以免疫印迹（Western blotting）结合串联质谱鉴定免疫原性蛋白[21]。鱼类作为低等脊椎动物，病原在体内引起的免疫应答反应与哺乳类小鼠和家兔明显不同，Verjan 等[22]利用兔多抗筛选的爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）免疫原性蛋白就不能与牙鮃的抗血清反应。因此，通过该方法筛选到的免疫原性蛋白往往不能对鱼体形成有效的免疫保护。一种更科学的方法是，将灭活后的病原免疫鱼体，收获抗血清作为一抗，以制备的抗宿主鱼体IgM 抗体为二抗，酶标抗体为三抗，Western blotting 筛选免疫原性蛋白。该方法筛选到的蛋白一般能很好地诱导鱼体免疫保护[13,14]。本研究制备了大黄鱼血清IgM 的鼠源多克隆抗体，ELISA 测定其效价达20 000，Western blotting 显示其可特异性结合IgM，可应用于后续大黄鱼病害的免疫防治研究中。

3.3 结论

本研究利用硫酸铵粗提结合Protein A 亲和层析纯化了大黄鱼血清IgM，并制备了具有良好结合特性的鼠源抗IgM 血清，可应用于大黄鱼机体免疫机制及病害防治研究。