采用HPLC-MS-AIS法测定钩藤中四种生物碱含量

张 燕 ，张 锁 ，丁 靖 ，魏 玮 ，赵彩萍 ，戴尊孝

（1.西安市精神卫生中心，陕西 西安 710100；2.西安市药学（精神卫生）重点实验室，陕西 西安 710100*通信作者：张 燕，E-mail：zy22661685@163.com）

钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤或无柄果钩藤的干燥带钩茎枝［1］，始载于《名医别录》，可用于治疗偏头痛［2］、焦虑［3］、老年痴呆［4］等。钩藤植物中生物碱约七十余种［5-6］。神经精神系统药效学研究显示，钩藤总碱可以恢复模型大鼠的学习记忆能力［7］；钩藤碱对癫痫有明显的抑制作用［8］；异钩藤碱具有镇静、促进睡眠［9］及改善帕金森症状的作用［10］；去氢钩藤碱及其异构体可以改善谷氨酸功能缺陷小鼠的探究行为［11］。作用强度与钩藤生物碱含量相关，故对其生物碱的准确测定尤为重要。

钩藤中有效生物碱成分主要为钩藤碱及其同分异构体、异钩藤碱及其同分异构体，上述四种物质可作为钩藤药材生物碱的质量标志物。目前，已报道的关于钩藤生物碱分析方法有高效液相色谱法（HPLC）［12-13］、液质联用法（HPLC-MS）［14-15］、毛细管电泳法（HPCE）［16-18］以及超高效液相色谱法（UPLC-MS）［19］等。上述方法存在诸多局限性，例如，HPLC分析时间较长，HPLC-MS采用外标法或是多组分定量使用同一个内标，均不利于样本的快速准确定量。高效液相-质谱联用-自体内标法（HPLC-MS-AIS）采用自体内标法（Autogenous Internal Standard，AIS），避免了 HPLC 分析时间过长、HPLC-MS外标法与被分析物质碰撞能量不同，因而在定量分析方法中具有独特优势。AIS是通过时间程序设定，使待测物与内标物质先后进入分离系统，实现利用化合物本身作为内标的新技术。本研究主要采用HPLC-MS-AIS技术测定钩藤中四种生物碱的含量，为钩藤药材的质量控制提供新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

液相色谱仪30AT、三重四极杆质谱仪8050CL、色谱工作站Version 5.81（日本岛津公司）；全自动液相色谱串联质谱耦合仪9500Ms-Mate（湖南德米特公司）；XW涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；吉尔森移液枪（吉尔森科技有限公司）；高速冷冻离心机HC-3616R（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；万分之一分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；Milli-Q Academic超纯水仪（美国Millipore公司）；电热套、循环水泵（上海晖创化学仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂

甲酸（天津市天力化学试剂有限公司）；分析级甲醇、分析级乙腈（美国安可化学公司）；钩藤碱对照品（LOT：C22M11S113789）、异钩藤碱对照品（LOT：P08A10S85061）、去氢钩藤碱对照品（LOT：MUST-12101703）、异去氢钩藤碱对照品（LOT：MUST-17092903）均购自成都曼思特生物科技有限公司；钩藤药材（四川成都荷花池中药材专业市场）。

1.3 色谱与质谱条件

色谱条件：C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，3.3 μm）；流动相A为0.1%甲酸（pH=4.2），流动相B为乙腈，A∶B=82∶18（v/v）；柱温30℃；流速0.5 mL/min；进样量2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源；正离子检测方式；多反应监测模式；干燥气流速10 L/min；雾器流速为3.0 L/min；接口温度300℃；毛细管电压为4 000 v；选择质子数/电荷数（m/z）：385.25/160.10（钩藤碱）、385.30/160.10（异钩藤碱）、383.25/160.15（去氢钩藤碱）、383.25/160.15（异去氢钩藤碱）作为检测离子对。

1.4 溶液配制

1.4.1 储备液配制

精确称取钩藤碱2.40 mg、异钩藤碱2.40 mg、去氢钩藤碱2.60 mg、异去氢钩藤碱2.60 mg于10 mL容量瓶，以甲醇定容至10 mL。将溶液进行4倍稀释，获得钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱混合对照品溶液，浓度分别为60.0、60.0、65.0、65.0 μg/mL，置于-20℃冰箱备用。

1.4.2 AIS溶液配制

精确吸取“1.4.1”项下配制的混合对照品溶液，流动相溶液作为稀释剂，配得内标溶液中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱浓度分别为0.40、0.40、0.45、0.45 ng/mL，在分析样本时，进样后2.0 min，切入分析系统，进样量50 μL。

1.4.3 对照品溶液及质控溶液制备

将“1.4.1”项中的混合对照品溶液吸取适量，用流动相逐级稀释得到不同浓度对照品溶液及质控溶液，钩藤碱和异钩藤碱系列浓度为2.30、23.04、115.20、288.00、480.00、600.00 ng/mL，高、中、低质控溶液标示浓度分别为5.40、270.00、540.00 ng/mL；去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱系列浓度为2.47、24.70、124.80、312.00、520.00、650.00 ng/mL，高、中、低质控溶液标示浓度分别为5.85、292.50、585.00 ng/mL。

1.4.4 药材供试品溶液制备

称取药材约30 g于圆底烧瓶中，加入300 mL水，接入回流装置，煮沸1 h。冷却至室温后，取适量提取液，经4℃、17 757×g离心10 min，精确吸取上清液1 mL至棕色瓶中，用流动相进行11倍稀释，密封保存。

1.5 分析性能评价

1.5.1 专属性

按照分析条件，将制备的供试品溶液进样，得到目标物色谱保留时间。各峰间无干扰则专属性良好。

1.5.2 线性范围

分别取系列对照品溶液100 μL，在色谱和质谱条件下依次进样。计算被测物质在不同浓度下峰面积与内标物峰面积的比值，然后将比值与浓度进行线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数，并以信噪比（S/N）=10为定量下限。

1.5.3 精密度

取1份对照品溶液，在分析条件下测定，连续进样6次。计算各对照品与AIS的峰面积比值的精密度。

1.5.4 准确度

取系列浓度对照品溶液及质控溶液，进样分析。对高、中、低浓度质控溶液各测定3次，计算各质控溶液测定浓度均值。准确度=（测定浓度均值/标示浓度）×100%。

1.5.5 稳定性

取供试品溶液，分别间隔0、6、12、24、48和72 h进样分析，按照标准曲线计算各成分的浓度，得到稳定性。

1.5.6 重复性

取6份钩藤药材各30 g，制备药材供试品溶液，进样分析，计算四种钩藤生物碱的重复性。

1.5.7 加样回收率

精确吸取药材供试品溶液6份，各100 μL，分别精确加入等量对照品溶液，进样分析，计算四种钩藤生物碱的加样回收率。

1.5.8 含量测定

取3份药材供试品溶液进行分析测定，并计算折合生药量。

1.6 统计方法

数据处理采用Lab Solution工作站，采用Excel进行计算，结果以（±s）表示，精密度、稳定性、重复性采用相对标准偏差（RSD）进行评价。

2 结 果

2.1 专属性

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱保留时间分别为4.88、3.50、2.91、3.73 min，见表1。色谱峰见图1，与AIS无相互干扰。

图1 各成分专属性结果色谱图Figure 1 Chromatogram of specific results for each component

表1 各化合物保留时间（min）Table 1 Retention time of each compound

2.2 定量线性范围

四种钩藤生物碱回归方程相关系数均＞0.99，其定量线性范围、检测下限、定量下限见表2。

表2 各成分的回归方程、线性范围、检测下限、定量下限Table 2 Regression equation，linear range，lower limit of detection and lower limit of quantification for each component

2.3 精密度、准确度和稳定性

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱精密度RSD分别为2.30%、1.10%、0.90%、1.70%，均＜3.00%。四种钩藤生物碱的高、中、低质控溶液浓度测定准确度为92.40%～104.10%。四种钩藤生物碱稳定性RSD分别为1.60%、3.50%、5.00%、1.80%，均≤5.00%。见表3。

表3 四种钩藤生物碱的精密度、准确度、稳定性Table 3 Precision，accuracy and stability of four kinds of alkaloids in Uncaria

2.4 重复性

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱含量RSD分别为2.80%、2.80%、4.90%、5.20%，均＜6.00%。

2.5 加样回收率

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱加样回收率分别为101.40%、104.60%、96.60%、95.90%，均在（100%±5%）范围内，RSD均＜3.00%。见表4。

表4 四种钩藤生物碱的回收率试验结果（n=6）Table 4 Recovery results of four kinds of alkaloids in Uncaria

2.6 样品测定结果

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱折合生药量分别为99.54、33.51、30.38、139.16 μg/g。见表5。

表5 钩藤生物碱含量测定结果Table 5 Results of alkaloid content determination of Uncaria

3 讨 论

有研究表明［20］，钩藤生物碱水溶液在酸性环境中更加稳定，故采用pH=4.2的0.1%甲酸水作为分离水相，其配制的流动相作为供试品的稀释溶液，保证了供试品溶液在酸性环境下的稳定性，并使钩藤生物碱色谱峰获得了良好的峰型。本研究定量分析的四种生物碱互为同分异构体［21］，化合物检测离子对相同，不能通过质谱定性，故需要借助液相色谱进行分离。采用甲醇和乙腈［22］作为移动相均有报道，本研究考察了3种流动相系统（乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇乙腈-0.1%甲酸水），结果表明乙腈-0.1%甲酸水分离效果最佳，同分异构体分离度良好，在8 min内实现了钩藤中四种生物碱的分离定量。

与池雨锋等［14］研究结果相比，本研究采用HPLC-MS-AIS方法测定的钩藤药材生物碱含量偏低，分析原因有两点：一是供试品制备时参照钩藤入药的传统方法，即将2～3 cm带钩茎枝水煎，未将钩藤饮片粉碎处理，钩藤药材粉碎度对水提取生物碱含量的影响较大［23］；二是不同产地的钩藤药材中生物碱的含量也可能存在差异［24］。

样本测定时由自动进样器先行进样，2.4 min后，液相串联质谱藕合仪通过阀切换将AIS和分析流路连通，内部的计量泵吸入50 μL AIS注入色谱柱前端，由流动相带入柱内分析。切入时间决定样本和AIS的分离程度，切入时间为2.4 min时，目标物与AIS色谱峰分离度＞1.5。目前，内标法定量通常使用同位素或物理化学性质类似的化合物，同位素具有弱放射性、昂贵、稳定性差的特点，性质类似的其他类型化合物与目标物分子的碎裂方式以及碰撞能量不同，对定量准确性存在一定的干扰。本研究中，AIS法使用目标物自身作为内标，弥补了其他类型内标的不足，并且每种化合物均有与之对应的内标，凸显了AIS法在多组分分析中的优势。

HPLC-MS-AIS方法将色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度以及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在测定钩藤生物碱含量中，具有准确、可靠、重现性好的特点，为钩藤药材质量控制提供了新方法。相较于HPLC 技术［12］，HPLC-MS技术根据化合物离子鉴别，洗脱时间更短；但与 UPLC-MS 方法［21］比较，HPLC-MS-AIS分析速度依然不足，有待进一步改进。