液相色谱串联质谱法测定人体血清中的类固醇激素

黄和飞，谷 叶，李佳兴，夏跃莲，何水兰，代秋琼，吕小波

昆明和合医学检验所有限公司 实验室，昆明 650106

类固醇是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来，其中包括雄激素、雌激素、孕激素和肾上腺皮质激素，是身体发育、性成熟及新陈代谢所必需的。类固醇激素的测定在临床疾病诊治中有着重要作用。人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺皮质增生症（CAH）、多囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等相关[1-3]，许多疾病存在类固醇激素的代谢异常，尤其是下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴疾病，且一种疾病常伴有多种类固醇激素异常。如CAH 即是一组因类固醇激素合成途径中酶缺陷引起的染色体隐性遗传病，而21-羟化酶缺乏（21-OHD）为最常见类型，导致皮质醇合成不足，前体物质17-羟基孕酮（17-OHP）增高[4-7]。

目前，类固醇激素的测定主要采用各种不同免疫分析方法，如放射免疫分析法、荧光免疫分析法和时间分辨荧光免疫分析法等。由于人体血清中类固醇激素水平相对较低，对检测方法要求很高，上述方法虽然能够达到一定的准确度，但仍存在交叉反应、基质干扰、灵敏度和特异性相对不高等情况，使检测结果的假阳性率增加，且每种激素的测定需使用不同试剂盒。液相色谱串联质谱技术（HPLC-MS/MS）具有一次性可检测多种物质、快速、灵敏度高和特异性强等优点[8-10]。近几年，国内外一些实验室已将该技术应用到临床检验的其他领域，包括药物浓度监测、新生儿遗传代谢病筛查、毒理学诊断等。

本研究旨在建立一种能同时检测且较文献方法灵敏的人血清中6 种类固醇激素的液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）方法，给临床疾病诊断和治疗提供可靠的参考方法和指导意义。

1 实验部分

1.1 仪器与药品、试剂

8050CL 高效液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS日本岛津）；医用高速离心机（湖南湘仪公司）；MD200-2 氮吹仪（杭州奥盛公司）；XA105 十万分之一天平（梅特勒公司）；多管涡旋振荡器（杭州米欧仪公司）。

标准品：孕酮（P）、17-羟基孕酮（17-OHP）、皮质醇（COL）、脱氢表雄酮（DHEA）、双氢睾酮（DHT）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）及对应的同位素内标，均购自西格玛公司（Sigma），纯度≥99.5%；甲醇为色谱纯（Merck）；甲基叔丁基醚（Merck）；屈臣氏蒸馏水；生理盐水替代空白基质血清。

方法学研究实验中的血清样本，来自昆明和合医学检验所有限公司2020 年7 月份送检的生物血清样本。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 分别精确称量标准品，用纯甲醇定容，然后分装并保存于-80 ℃备用。取适量标准储备液，根据Mayo、Quest 中临床报告参考范围进行6 种类固醇激素标准曲线配制，稀释液为甲醇∶水=7∶3。

1.2.2 对照品工作液及内标工作液配制 分别称取孕酮、17-羟基孕酮、皮质醇、双氢睾酮及内标5 mg于5 mL 量瓶中，甲醇∶水=7∶3 定容，分别得到对照品储备液浓度为990.00、990.00、1000.00、990.00 μg·mL-1，用600 μL 离心管分装，每管分装体积400 μL，内标储备液浓度均为1000.00μg·mL-1，脱氢表雄酮及内标、硫酸脱氢表雄酮及内标均为1 mL 液体，浓度1000.00 μg·mL-1，用200 μL 离心管分装，每管分装体积100 μL，-80 ℃保存。

根据上述对照品及内标母液浓度分别配制6 种类固醇激素标准曲线，浓度分别为孕酮：3.915、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1；17-OH 孕酮：0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL-1；皮质醇：3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1；双氢睾酮：0.08、0.16、0.32、0.63、1.25、2.505.00、10.00 μg·mL-1；脱氢表雄酮：1.17、2.34、4.69、9.39、18.75、37.50、75.00、150.00 μg·mL-1；硫酸脱氢表雄酮：31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00、2000.00、4000.00 μg·mL-1，稀释液为甲醇∶水=7∶3。类固醇激素的标准曲线回归方程见表1。

表1 类固醇激素的标准曲线回归方程

1.2.3 样本前处理 移液枪分别移取10 μL 内标和100 μL 血清样本至1.5 mL 离心管，加入甲基叔丁基醚800 μL，振荡混匀5 min 后离心10 min，取上清液700 μL 用氮气吹干，再用甲醇100 μL 复溶，振荡混匀1 min，高速离心10 min，最后取上清液90 μL 进行LC-MS/MS 分析。

1.2.4 色谱条件 色谱柱：安捷伦C18（100mm×2.1mm，1.8μm）；流动相A 为纯水，流动相B 为甲醇（0.1%FA）（梯度洗脱，见表2）；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL。

表2 液相色谱流动相洗脱程序

1.2.5 质谱条件 采用电喷雾电离（ESI）源，MRM扫描模式，雾化气流速3 L·min-1，加热气流速10 L·min-1，接口温度300 ℃，DL 温度300 ℃，加热块温度400 ℃，干燥器流量10 L·min-1。类固醇质谱参数见表3。

表3 类固醇激素的MRM 质谱检测条件

2 结果

2.1 LC-MS/MS 条件优化

为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物响应值，采用MRM 模式对化合物离子对（Q1、Q3）进行监测。首先是质谱方法建立和条件优化，在仪器已经检定校准条件下，经过3 个步骤：第1 步，Q1 SCAN 确定母离子的质荷比；第二步，通过母离子找到产物离子，即子离子；第三步，根据母、子离子构成MRM 离子对，进行MRM 电压和碰撞能优化，从中找到最佳电压参数。其次，对离子源参数进行调整优化，以保证目标物达到最佳响应强度。最后，优化色谱条件，连接LC-MS，并接色谱柱进行平衡，设置流动相比例，使目标物类固醇激素与杂质干扰峰分离。检测结果见图1～图12。

图1 孕酮色谱图

图2 孕酮质谱图

图3 17-OH 孕酮色谱图

图4 17-OH 孕酮质谱图

图5 皮质醇色谱图

图6 皮质醇质谱图

图7 脱氢表雄酮色谱图

图8 脱氢表雄酮质谱图

图9 双氢睾酮色谱图

图10 双氢睾酮质谱图

图11 硫酸脱氢表雄酮色谱图

图12 硫酸脱氢表雄酮质谱图

2.2 内标法定量

利用仪器软件“LabSolutions”中“Quant Broswer”浏览器建立校准曲线，并分别计算出血清中6 种物质的浓度，以信噪比（S/N）等于3 时所对应的目标物浓度作为方法的检测限（LOD），以信噪比（S/N）等于10 时所对应的目标物浓度作为方法的定量限（LOQ）。类固醇激素的线性拟合、检测限、定量限结果见表4。

表4 6 种类固醇激素的线性拟合、检出限和定量限结果

2.3 精密度试验

按照“1.2.3”的前处理方法分别进行日内、日间精密度试验，同一台仪器，日内精密度需一天内，在不同时间段处理3 批次样本（低、中、高浓度），每个浓度样本5 个进行实验。日间精密度需3 天完成，每天处理一批次样本（低、中、高浓度），每个浓度样本5 个进行实验。最终分别计算日内、日间低、中、高样本浓度的平均值（x）、标准偏差（s）及相对标准偏差（CV）值。6 种类固醇激素精密度结果见表5。

表5 6 种类固醇激素的精密度结果

2.4 回收率试验

随机选取一份患者血清样本，避开溶血、乳糜及黄疸不合格标本，其中1 份不加标准品，其它3份分别加入低、中、高3 个浓度的标准品，以“1.2.3”的前处理步骤进行处理并重复测定3 次，计算回收率。6 种类固醇激素加标回收率结果见表6。

表6 6 种类固醇激素的回收率结果

2.5 标准曲线线性范围考察

在规定范围内测定线性关系：经精密称量，制备一系列供试样品进行测定，制备5 份标准工作溶液，分别经“1.2.3”的前处理后上样检测，以测得的目标物峰面积/内标峰面积作为被测物浓度的线性方程。结果见表7。

表7 6 种类固醇激素的标准线性方程

2.6 基质效应考察

设计原则：取6 份来源不同的基质样本（基质样本要求是不同性别、不同年龄段），在同一份高浓度（浓度≥10×基质样本中浓度）的标准溶液中加入不同基质比例的样本（90%、80%、60%、40%、20%、10%、0 的基质），每个基质样本考察7 个不同比例条件，按照《中国药典》2020 年版四部“9012 生物样品定量分析方法验证指导原则”中基质效应试验方法进行，比较待测物峰面积及内标峰面积比值。之后的操作步骤同“1.2.3”的血样前处理一致。

6 种类固醇激素在6 批次基质血样所对应的7个不同比例条件中，变异系数均小于15%，结果表明该方法的基质效应可以忽略不计。

2.7 稳定性试验

本实验分别考察质控样本4 ℃放置（3、6、15、24、48、72 h）、-20 ℃和-80 ℃放置（1、7、30、90、180、360 d）的稳定性，在每个条件下，每份样本平行制备3 份。17-OH 孕酮、皮质醇、孕酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、双氢睾酮质控样本4 ℃放置72 h、-20 ℃和-80 ℃放置360 天均稳定。

3 讨论

因免疫法灵敏度低、基质干扰大等缺点，为了提高分析检测的灵敏度，降低基质效应，目前有关文献报道，采用柱前衍生化法、固相萃取法（SPE）、蛋白沉淀（PPT）结合固相萃取法（SPE）进行前处理提取；但因其存在衍生化法耗时长、固相萃取法成本费用高等缺点[8，9]，因此，本研究建立了HPLC-MS/MS 同时测定人血清中6 种类固醇激素浓度的检测方法。该方法前处理采用简单经济的液液萃取，将6个目标化合物完全提取后经LC-MS/MS 进行准确定量分析，结果显示，血清中6 种类固醇激素检出限（LOD，以S/N≥3 为标准）为0.03～1.25 ng·mL-1；定量限（LOQ，以S/N≥10 为标准）为0.05～2.50 ng·mL-1范围内线性关系良好，相关系数（r）≥0.995 0；低浓度样本日内精密度为2.4%～6.2%；中浓度样本日内精密度为2.3%～5.7%；高浓度样本日内精密度为1.3%～5.4%。低浓度样本日间精密度为0.4%～2.6%；中浓度样本日间精密度为0.3%～3.9%；高浓度样本日间精密度为0.2%～4.7%。加标回收率为86%～106%。因此，该检测方法的精密度、回收率完全满足血清中6 种类固醇激素的定量分析。可以给临床激素相关的疾病诊断和治疗提供可靠的参考方法和指导意义。