基于HPLC 指纹图谱结合多元统计分析不同炮制方式对九制女贞子化学成分的影响*

姜誉弘，姚 毅，刘史佳，刘志辉，任 娟，俞 凡，庞会明

南京中医药大学附属医院/江苏省中医院 药学部，南京 210029

女贞子（Ligustri Lucidi Fructus）为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、明目乌发的功效[1]。文献报道，女贞子含有三萜类、黄酮类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类、多糖类、挥发油、脂肪酸、氨基酸和各种微量元素等[2-5]。现代药理研究表明，女贞子具有抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、免疫调节、降血糖、调血脂等多种药理作用[2，4]。在《本草述校注》[5]中记载“女贞实一斗，如法去皮，每斗用马料黑豆一斗。拣净淘洗，同蒸透，九蒸九晒蒸女贞实，先将上好老酒浸一宿，次日用黑豆蒸，如此者九，以其性寒故也”，即九制后的女贞子可去除其寒性，用于各类制剂中，例如，本院特色制剂延年益寿丹，具有滋补肝肾、固本培元的功效，其中4 味中药需要九蒸九晒，女贞子就是其中之一。

九蒸九晒法以中医药理论为基础，具体是根据药材自身性质的需要而采取一系列加工处理技术[6]。中药经过九制后主要改变可归纳为三类：①可以改变药性。例如地黄[7]炮制后性转温，功效由清转补，以滋阴补血为主。②增加疗效。例如黄精[8]增其厚重之气，克其湿腻之性，强其补益之效。③降低毒性。例如何首乌[9]九制后游离蒽醌含量增加，二苯乙烯苷含量降低。九蒸九晒法因受限于气候、温度、湿度及制药周期长、药材因未及时晒干而发霉变质等，无奈被弃用。因此本研究提出用九蒸九烘法代替九蒸九晒法，通过对两种干燥工艺下女贞子性状、浸出物和化学成分变化的比较，为后续九制女贞子大生产和分析鉴定提供理论基础，让特色制剂造福民众。

1 仪器与药品、试剂

e2695 高效液相色谱色谱仪（含2998 型PDA 检测器，Empower 工作站，美国Waters 公司）；BP211D十万分之一电子天平（赛多利斯公司）；SK6200H 超声清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；CT-C-11热风循环烘箱（杭州金竺机械有限公司）。

18 批女贞子生品饮片产地分别为湖南（S1～S6）、贵州（S7～S12）、江苏（S13～S18），经江苏省中医院刘志辉主任中药师鉴定确认。酒蒸女贞子按照《中国药典》2020 版女贞子项下的炮制方法制备。

对照品：女贞苷（批号：P26D9F78576）、橄榄苦苷（批号：P02M11L109137）、红景天苷（批号：N26A11X111127）、新女贞苷（批号：S01O11D126 004）、特女贞苷（批号：P02D11L133055）均购自上海源叶生物科技有限公司；木犀草苷（批号：111720-201810）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201914）、松果菊苷（批号：111670-201907）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 女贞子炮制品的制备

取湖南（S1）、贵州（S7）和江苏（S13）3 个产地女贞子生品，按下述方法进行九蒸九晒和九蒸九烘：

晒干炮制品 取女贞子10 kg 加2 kg 黄酒拌匀，置于蒸锅中蒸10 h 至无白心，阳光下自然晒干，取500 g 留样。复蒸10 h，阳光下自然晒干，如此重复8 次，每蒸晒1 次，分别取500 g 留样，即得女贞子九蒸九晒成品。

烘干炮制品 取女贞子10 kg 加2 kg 黄酒拌匀，置于蒸锅中蒸10 h 至无白心，60 ℃烘干，取500 g留样。复蒸10 h，60 ℃烘干，如此重复8 次，每蒸晒1次，分别取500 g 留样，即得女贞子九蒸九烘成品。

炮制后，本品形如女贞子，表面黑褐色或灰黑色，常附有白色粉霜，微有酒香气。经九蒸九晒和九蒸九烘工艺，饮片的整体颜色由棕褐色转变为黑褐色，白霜逐渐减少。第9 次炮制后，女贞子表面有明显光泽，具黏性。两种干燥工艺的饮片外观性状无显著差异，见图1。

图1 女贞子炮制品

2.2 女贞子不同炮制程度的浸出物测定

按照《中国药典》2020 版“醇溶性浸出物测定法”（通则2201）项下的热浸法，取本品粉末（过2 号筛）约4 g，精密称定，置250 mL 的锥形瓶中，加30%乙醇100 mL，密塞，称定重量，静置1 h 后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，精密称定重量。

除另有规定外，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量（%）。结果见表1 和图2。

图2 醇溶性浸出物结果

表1 女贞子醇溶性浸出物结果（%）

在九蒸九晒和九蒸九烘过程中，醇溶性浸出物整体呈逐渐下降趋势，但第9 次炮制后，晒干品和烘干品的浸出物含量均明显上升；与生品比较，炮制品的浸出物含量稍有降低；与第9 次晒干品比较，第9次烘干品浸出物含量稍微减少，但无显著差异。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取女贞苷、橄榄苦苷、红景天苷、新女贞苷、特女贞苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷对照品适量，加甲醇配制得到浓度分别为1.087、0.691、1.056、0.956、1.100、149.300、150.000、1.056 mg·mL-1的各对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取女贞子粉末（过3 号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇30 mL，称定重量，超声处理（功率480 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，以0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6mm×100mm，2.7μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脱：0～25 min，5%～13%B；25～40 min，13%B；40～85 min，13%～35%B；85～100 min，35%～90%B）；柱温：30 ℃；检测波长：240 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 取同一批女贞子生品饮片（江苏S13），按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.5”项下色谱条件进样测定，连续6 次，记录色谱图。以特女贞苷峰（20 号峰）的保留时间和峰面积作为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均＜5%，表明仪器的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.6.2 稳定性试验 取同一批女贞子生品饮片（江苏S13），按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.5”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、12、24 h 进样测定，记录色谱图。以特女贞苷峰（20 号峰）的保留时间和峰面积作为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均＜5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.6.3 重复性试验 取同一批女贞子生品饮片（江苏S13），按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按照“2.5”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以特女贞苷峰（20 号峰）的保留时间和峰面积作为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均＜5%，表明方法重复性良好，符合指纹图谱的要求。

2.7 女贞子生品指纹图谱建立和相似度评价

按照“2.4”项下方法制备18 批女贞子生品供试品溶液，按照“2.5”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将得到18 批女贞子测定结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版）》进行分析，设置S1 为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.1，经过多点校正后自动匹配，生成对照图谱R，该图谱作为女贞子生品的标准指纹图谱，图谱中共确定26 个共有峰，结果见图3。

将18 批女贞子样品与对照指纹图谱匹配，进行相似度评价，结果各批次女贞子生品与对照指纹图谱之间的相似度在0.880～0.999，表明各批次之间一致性较好。本方法可用于综合评价女贞子样品。

2.8 共有峰的归属

女贞子生品检出26 个色谱峰，归属8 个色谱峰，见图3。

图3 18 批女贞子生品HPLC 指纹图谱（A）及其共有模式（B）

2.9 女贞子不同炮制品HPLC 指纹图谱色谱峰的归属与比较

按照“2.4”项下方法制备女贞子九蒸九晒和九蒸九烘供试品溶液，按照“2.5”项下色谱条件测定，记录色谱图，以湖南为例，结果见图4。记录各色谱峰峰面积，计算第9 次晒干品和第9 次烘干品各色谱峰的单位质量（g）峰面积（A），结果见表2。根据已知对照品的保留时间对炮制品中的色谱峰进行归属。

表2 女贞子第9 次晒干和第9 次烘干炮制品的色谱峰比较

图4 女贞子生品及不同炮制程度的HPLC 指纹图谱（湖南）

结合色谱图结果和峰面积比值，进行分析：1、4（红景天苷）、5、6、7、8、22 号峰在炮制过程中均呈现逐渐增加的趋势；9、13（松果菊苷）、15（木犀草苷）、18（毛蕊花糖苷）、19（女贞苷）、20（特女贞苷）、23 和25 号峰在炮制过程中均依次降低；2、3、11、12、14、16（新女贞苷）、17、21（橄榄苦苷）和24 号峰在炮制过程中峰面积逐渐降低直至消失；10 和26 号峰，考虑存在误差因素，可视为不变。

新成分a 在第1 次炮制后显著生成，且在后续炮制过程中逐渐增加，九蒸九晒和九蒸九烘增加程度无显著差异；新成分b 在炮制过程中呈现逐渐增加的趋势；新成分c 在炮制过程中呈现逐渐增加的趋势，九蒸九晒和九蒸九烘工艺结果无显著差异。

2.10 聚类分析

以生品女贞子和第9 次炮制品共有峰的相对峰面积为变量，导入SPSS 26.0 统计软件进行聚类分析。Z 标准化后采用瓦尔德法，以平方欧式距离作为样品相似度的距离公式，结果见图5。聚类分析结果表明，当平方欧式距离为5～10 时，样品可分为3类：贵州、江苏和湖南生品聚为一类；湖南第9 次晒干和湖南第9 次烘干聚为一类；贵州第9 次晒干和烘干、江苏第9 次晒干和烘干聚为一类。表明女贞子晒干和烘干两种干燥工艺均聚为一类，无差异。

图5 女贞子生品和炮制品聚类分析

3 讨论与小结

3.1 检测波长的选择

对女贞子样品进行了全波长扫描，参照文献[10,11]并比较了230、240、280 nm 波长下，女贞子样品中色谱峰的归属，表明在240 nm 波长下生品和炮制品的色谱峰最多，响应最强，故选择其作为检测波长。

3.2 溶剂的选择

本试验分别考察了50%乙醇与70%乙醇、50%甲醇与70%甲醇作为样品溶剂，进行超声提取，结果表明，当70%甲醇作为溶剂提取时，女贞子样品的色谱峰最多，响应也最强，提取最完全，因此选择70%甲醇作为样品的溶剂。

3.3 流动相的选择

参照文献[10，11]报道，本试验分别对水-乙腈、0.2%磷酸水-乙腈和0.1%甲酸水-乙腈作为流动相系统进行考察。结果表明，各流动相条件下，色谱峰的出峰时间相差不大；但是在0.1%甲酸-乙腈的流动相系统下，色谱峰的分离度和峰型较好，显著改善了其他流动相系统中出现的拖尾、肩峰等问题。

本试验首先通过高效液相色谱法建立了女贞子生品的指纹图谱，包括了18 个批次女贞子来自3个产地，对女贞子中各成分进行初步归属与分析。参照《中国药典》和文献报道的工艺条件，对女贞子进行九蒸九晒和九蒸九烘的炮制工艺，并考察了炮制过程中醇溶性浸出物的变化，结果表明，九蒸九晒和九蒸九烘工艺无显著差异。

本试验通过指纹图谱结果，系统地分析了女贞子从一蒸一晒（烘）到九蒸九晒（烘）全过程，在检出的26 个色谱峰中，有7 个色谱峰呈现含量增加的趋势（红景天苷等），17 个色谱峰呈现降低的趋势（9 个色谱峰在九制后的成品中消失），2 个色谱峰在整个炮制过程中呈现不变化的特征。新成分a、b、c 在炮制过程中均逐渐增加，根据其出峰时间、前后化合物的指认和相关文献报道[12，13]，推测新成分a 和b 可能为醛类和苯乙醇类；新成分c 可能为环烯醚萜苷类。结合HCA 结果分析，两种炮制工艺无显著差异，无论是浸出物结果还是化学成分的变化和程度均呈现一致性，可考虑用九蒸九烘的工艺代替传统九蒸九晒工艺，以避免大生产中出现因生产周期长、饮片发霉变质等问题。