川芎-天麻对硝酸甘油偏头痛大鼠硬脑膜血浆蛋白外渗影响

刘露露 章正祥 韦钦 吴雨佳 于文静 曹志坚

偏头痛是世界排名第二的致残性疾病［1］，全球年患病率约15%［2］。频繁和严重的头痛致患者生活质量严重下降。偏头痛的机制与三叉神经血管反射学说密切相关，血浆蛋白外渗（plasma protein extravasation，PPE）在其中发挥重要作用。硬脑膜PPE是偏头痛动物模型的关键病理指标之一，也是引发偏头痛神经源性炎症反应的一个重要特征［3］。近年来，中医药治疗偏头痛的作用不断得到肯定，川芎、天麻是最常用的一个药对，即《圣济总录》的大芎丸或《宣明论方》的大川芎丸。前期研究显示，川芎-天麻可以有效改善头痛，但对偏头痛的影响尚未明确［4］。本研究旨在观察川芎-天麻对硝酸甘油偏头痛模型大鼠硬脑膜血浆蛋白外渗的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠36只，体质量180～220（232±12）g，购自杭州医学院，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。分笼饲养于浙江中医药大学动物实验中心，动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012。饲养条件符合国家标准，自然昼夜，棒状饲料喂养，自由饮水。研究方案获得浙江中医药大学动物实验中心伦理审批，批件号：IACUC-20200907-05。

1.2 药品与试剂 妥泰购自西安杨森制药有限公司（批号：KEJOKUL），天麻颗粒剂（批号：2003003S）、川芎颗粒剂（批号：1910004C）均购自华润三九医药股份有限公司。硝酸甘油（批号：190506L）购自山东圣鲁制药有限公司。伊文思蓝粉末（Lot.No 619N041，Cat.No E8010）、甘油明胶封片剂购自Lot.No 20200730，Cat.No S2150）均购自Solarbio公司。

1.3 仪器 激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）购于德国徕卡公司；电热鼓风干燥箱（型号：DHG-9030A）购于上海-恒仪器有限公司；4 ℃医用冰箱（型号：YC-968L）购于中科美菱低温科技股份有限公司。

1.4 实验方法 （1）分组：36只雄性SD大鼠编号称重，随机分成4组，每组各9只，分别为对照组、模型组、妥泰组、川芎-天麻组。（2）灌胃与造模：对照组、模型组分别每日灌胃纯水1 mL/100 g，妥泰组每日灌胃妥泰1 mL/100 g，川芎-天麻组每日灌胃川芎-天麻1 mL/100 g，连续给药7 d，每日固定时间段灌胃1次。模型组、妥泰组、川芎-天麻组在第7天灌胃后于玻璃箱中适应，0.5 h后进行腹腔注射硝酸甘油（10 mg/kg，0.2 mL/100 g）造模，对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液（0.2 mL/100 g），造模后置于玻璃箱中，并于安静环境下，在固定时间段通过摄像机录像，进行行为学观察，观察指标为挠头、理毛、爬笼、咬尾等，观察行为学后根据计算好的时间对大鼠进行麻醉。（3）麻醉与取材：3 h后，按照时间分别给大鼠腹腔注射3%浓度戊巴比妥钠进行麻醉（50 mg/kg，0.1667 mL/100 g）。待大鼠完全麻醉后，于锁骨上方暴露右侧颈外静脉，从颈外静脉缓慢注入2%伊文思蓝（5 mg/100 g，0.25 mL/100 g），大鼠四肢末端、口、眼球、肝脏等组织可见蓝染现象。1 h后对大鼠进行开胸，剪开大鼠胸骨，暴露心脏，右手持灌胃针头刺入心尖，直至灌胃针进入主动脉，破坏右心耳，用止血钳夹住并固定灌胃针，并用50 mL注射器连接灌胃针，随后用0.9%氯化钠溶液经心脏灌注300～350 mL，即可见流出液体澄清。然后对大鼠进行断头开颅，立即小心完整分离硬脑膜。

1.5 观察指标 将取出的硬脑膜用去离子水冲洗3～4次，平铺于载玻片上，置于37℃烘箱中15～20 min烘干，用甘油明胶封片剂封片，然后使用激光共聚焦显微镜在100倍镜下拍摄双侧硬脑膜血浆蛋白渗出情况。荧光波长设在670～740 nm，红光（638）：1%，其余设置均不变。拍摄区域主要定在脑膜中动脉各分支交叉处，分支及主干交叉处，选定面积大小为40,000～80,000 μm2，每张硬脑膜标本双侧各取3个拍摄区域，用image j计算各个选定的灰度值均值。计算公式为：灰度值均值=灰度值（IntDen）/面积（area）。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 硝酸甘油偏头痛大鼠硬脑膜伊文思蓝染色 见图1。

图1 硝酸甘油偏头痛大鼠硬脑膜伊文思蓝染色（×100）

2.2 与对照组比较，模型组硬脑膜血浆蛋白外渗明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，妥泰组（P=0.031）和川芎-天麻组（P＜0.001）硬脑膜血浆蛋白外渗均明显降低，且川芎-天麻组优于妥泰组，差异有统计学意义。见图2。

图2 川芎-天麻对硝酸甘油偏头痛大鼠硬脑膜血管通透性影响比较

3 讨论

偏头痛是原发性头痛中最常见的类型，发病机制尚未完全明确，胃肠神经功能障碍交互混合，发作频繁［5］，治疗困难。随着社会的发展，现代人的压力越来越大，生活节奏越来越快，偏头痛的发病率日趋上升，而且女性发病率远远高于男性［6］。偏头痛在中医理论上中属于“头风”“头痛”“厥头痛”等范畴，“头痛”一词首载于《黄帝内经》，且认为其病因与风有关。中医对偏头痛的认识不断完善，而且中药治疗偏头痛有丰富的经验和独特的优势，可以预防偏头痛发作，还可有效缓解偏头痛症状。川芎［7］、天麻［8］具有显著的抗炎镇痛、神经保护、抗氧化作用。川芎有效成分［9］和天麻素［10］均可改善脑部循环，增加脑血流量，缓解头痛发作。有研究表明，川芎、天麻治疗血管性头痛的有效率可达80%以上，川芎-天麻中的有效成分具有良好的抗炎镇痛作用，并且可以改善微循环、扩张脑血管，调节与保护血管舒张功能，还可以起到保护神经的作用［11］。偏头痛的发病机制与颅内血管密切相关，川芎、天麻均可以作用于脑部血管，调节脑循环等作用来缓解头痛，基于川芎-天麻的以上作用，此药对可有效防治偏头痛。

目前关于偏头痛的发病机制比较复杂，在众多学说中，主要倾向于三叉神经血管学说，其次是皮质扩散抑制（cortical spreading depression，CSD）学说。在三叉神经血管学说中，偏头痛的发病与三叉神经血管系统（trigeminal vascular system，TGVS）的激活密不可分，各种刺激作为偏头痛的触发点，随后导致CSD，然后激活TGVS，致使三叉神经末梢释放血管活性物质如降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、P物质等［12］。TGVS激活还可导致一系列神经源性炎症（neurogenic inflammation，NI）的反应，如神经源性硬脑膜血管的扩张（neurogenic dural vasodilatation，NDV）、脑膜肥大细胞肿胀脱颗粒和硬脑膜PPE等，从而引起痛觉超敏反应，引发偏头痛［3］。

本研究采用腹腔注射硝酸甘油建立血管舒缩异常偏头痛大鼠模型，有研究发现，硝酸甘油可以通过刺激大鼠神经末梢释放血管活性物质，这种释放引起脑膜血管舒张，使硬脑膜血浆蛋白渗出增加，并释放白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β等，致使大鼠发生神经源性炎症偏头痛［13］。本实验建立的硝酸甘油偏头痛模型大鼠硬脑膜血浆蛋白外渗明显升高，与文献符合。

本研究显示模型组和对照组相比，模型组血浆蛋白渗出明显升高。与模型组相比，川芎-天麻组和妥泰组均能够显著降低硬脑膜血浆蛋白的渗出，且川芎-天麻组优于妥泰组，提示川芎-天麻、妥泰可能通过抑制血管扩张，从而抑制PPE，发挥抗神经源性炎症作用，有效缓解硝酸甘油造成的大鼠炎症性偏头痛。本研究证实了川芎-天麻对PPE有一定程度的抑制作用，川芎-天麻通过作用于颅内血管这一靶点对偏头痛起到预防性治疗作用。

在头痛治疗中，引经药使用是中医治疗头痛的特点与优势。头痛或者伴随症状的缓解是偏头痛现代治疗所有药物的作用靶点。头痛性质多样，或胀痛，或刺痛，或隐痛，中医可根据疼痛性质给予相应的加减，川芎、天麻活血行气，对胀痛，刺痛有较好的疗效。头痛部位或左，或右，或前额，或后项，部位不一。《汤液本草》曰：“头痛需用川芎，如不愈者各加引经药。太阳川芎，阳明白芷，少阳柴胡，太阴苍术，少阴细辛，厥阴吴茱萸。”头痛引经药根据头痛经络循行部位，引药入病所，增加疗效。川芎引药入太阳、少阳两经《中医内科学》（新世纪第五版），天麻为足厥阴专药。川芎天麻合用，覆盖巅顶、两侧、后项部头痛。川芎-天麻可看作引经药来治疗偏头痛，通过预防性用药，改善偏头痛患者头痛发作的严重程度，降低偏头痛发作的频率，减缓每次头痛的持续时间等临床症状，其具体作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，本研究以临床常用中药川芎-天麻药对为对象，通过动物实验研究，得出川芎-天麻能够降低硬脑膜血浆蛋白的渗出，抑制大鼠神经源性炎症，有效缓解硝酸甘油造成的大鼠炎症性偏头痛。研究结果也为川芎-天麻制剂对偏头痛的治疗提供一定的实验依据。