汉黄芩苷通过调控AKT信号通路促进肝癌细胞HepG2凋亡的研究

李鑫芳 郑伟 叶昂直

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，主要发生于肝细胞或肝内胆管细胞［1］。寻找能够有效抑制肝癌细胞增殖的小分子物质可为肝癌的治疗提供新的治疗药物，同时有望改善肝癌患者的预后。近年来，中药单体及衍生物已被证明在多种癌症模型中发挥抗癌作用［2-3］。汉黄芩苷为黄芩中特有成分，其在癌症治疗中的作用逐渐为人所熟知。CHEN等［4］研究结果显示，汉黄芩苷通过ERhippo信号轴抑制子宫内膜癌的肿瘤生长和转移。YAO等［5］研究显示，汉黄芩苷通过抑制TRAF2/4的表达抑制乳腺癌的侵袭和迁移。本研究拟通过体外实验阐明汉黄芩苷在肝癌治疗中的作用及其分子调控机制，研究汉黄芩苷对肝癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）细胞株：人肝癌细胞HepG2由中国科学院上海生命科学院细胞资源中心提供。（2）试剂与仪器：汉黄芩苷购于上海源叶生物科技有限公司；AKT特异性激动剂SC79购于MCE公司；兔抗小鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体购于Abcam公司；兔抗小鼠GAPDH、Caspase-3、Akt、p-Akt单克隆抗体与山羊抗兔IgG二抗购于CST公司；DMEM高糖培养基购于Gibco公司；BCA蛋白检测试剂盒购于碧云天公司；凝胶成像分析系统、电泳槽购于Bio-Rad公司；CO2培养箱购于Salvis Lab公司；MultiskanTM FC型酶标仪购于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法 （1）细胞培养：用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基处理并培养于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中。（2）细胞增殖实验：用胰酶消化肝癌细胞HepG2，离心后将细胞重悬，制备肝癌细胞HepG2悬液并计数细胞数量将肝癌细胞HepG2稀释至合适的铺板细胞数后接种到96孔板内，待肝癌细胞HepG2贴壁后给予不同浓度的汉黄芩苷处理，每个浓度设置3个复孔，并置于37 ℃培养箱中培养24 h。最后，向每个孔内加入10 μL CCK-8试剂，测定450 nm处的吸光度并统计分析。（3）Western blot实验：通过蛋白裂解液对肝癌细胞进行裂解，冰上静置30 min后放入离心机中以12,000 r/min离心30 min，收集上清液并检测总蛋白浓度，用10%分离胶分离蛋白样本，在300 mA电流条件下转膜，封闭2 h，放入GAPDH（1∶5,000）、AKT（1∶1,000）、p-AKT（1∶1,000）、Caspase-3（1∶1,000）、Bax（1∶1,000）和Bcl-2（1∶1,000）一抗稀释液中孵育过夜。第二天，用TBS-Tween洗涤3次后，二抗稀释液孵育2 h并再次洗涤3次，曝光各蛋白条带并用Image Lab软件分析条带灰度值。Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白以GAPDH蛋白条带作内参照；p-AKT蛋白分别以AKT蛋白条带作参照。（4）流式细胞学实验：给予肝癌细胞HepG2汉黄芩苷和AKT激动剂处理后，用10 mL的离心管收集肝癌细胞，将细胞浓度控制在3×106/mL，以1,000 r/min速度离心5 min，弃去上清液，用孵育缓冲液洗涤1次，再次离心。用100 μL标记溶液重悬肝癌细胞，在室温避光环境下孵育15 min，再次离心和洗涤肝癌细胞1次，向肝癌细胞内加入荧光溶液并孵育于4 ℃环境中20 min。最后，调节系统参数通过流式细胞分析仪进行相应的检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉黄芩苷剂量依赖性抑制肝癌细胞HepG2增殖能力 CCK-8实验结果显示，与对照组比较，给予汉黄芩苷处理可抑制肝癌细胞的增殖能力，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 不同剂量汉黄芩苷处理对肝癌细胞HepG2细胞增殖能力比较

2.2 汉黄芩苷激活肝癌细胞HepG2凋亡反应 Western blot实验结果显示，与对照组比较，给予汉黄芩苷处理可显著上调肝癌细胞内凋亡相关蛋白Casepase-3和Bax的表达水平，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。与此同时，给予AKT特异性激动剂SC79处理后肝癌细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和Bax的表达水平与汉黄芩苷治疗组相比显著降低，而抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平显著增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 汉黄芩苷对肝癌细胞内Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较

2.3 汉黄芩苷促进肝癌细胞HepG2凋亡程度 流式细胞学实验结果显示，与对照组比较，给予汉黄芩苷处理可显著促进肝癌细胞的凋亡程度,差异有统计学意义（P＜0.05）。与此同时，给予AKT特异性激动剂SC79处理后，汉黄芩苷对肝癌细胞凋亡程度的促进作用与汉黄芩苷治疗组相比受到显著抑制，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 汉黄芩苷对肝癌细胞HepG2凋亡水平比较

2.4 汉黄芩苷通过调控AKT信号通路促进肝癌细胞凋亡 Western blot实验结果显示，与对照组比较，给予汉黄芩苷处理可显著抑制肝癌细胞内AKT蛋白磷酸化水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。与此同时，给予AKT特异性激动剂SC79处理后，肝癌细胞内AKT蛋白磷酸化水平与汉黄芩苷治疗组相比显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 汉黄芩苷对肝癌细胞内AKT蛋白磷酸化水平比较

3 讨论

随着我国肝病人数的增加，PHC的发病人数逐年增加，PHC已经成为严重威胁我国人民健康的消化道恶性肿瘤之一。PHC主要有三种不同的病理类型，包括肝细胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）、肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCCICC混合型。HCC的发病率最高，占总数的85%～90%。该病起病隐匿，早期无明显不适，一旦出现典型的临床症状和体征显示已进入疾病的中晚期，因此肝癌患者的5年生存率较低。随着分子靶向药物研发速度的加快，患者的5年生存率取得了大幅的提升，但由于肿瘤靶向药物的适用人群较为狭隘且治疗费用普遍较为昂贵，因此绝大部分肝癌患者的生存率仍较低［6］。寻找更多能够有效抑制癌症细胞增殖且价格低廉的抗癌药物可进一步改善肝癌患者的远期疗效。本课题组主要研究汉黄芩苷在抑制肝癌细胞HepG2增殖、促进肝癌细胞HepG2凋亡过程中的作用以期为汉黄芩苷治疗肝癌提供实验依据。

汉黄芩苷对癌症细胞生长的抑制作用已在多项基础研究中被证实，且抑制癌症细胞增殖和诱导癌症细胞死亡是其发挥抗癌作用的主要方式。LUO等［7］研究结果显示，汉黄芩苷可通过促进线粒体功能障碍诱导人非小细胞肺癌A549细胞凋亡。WANG 等［8］研究结果显示，汉黄芩苷通过调节Bcl-2和Bax诱导骨肉瘤细胞周期阻滞和线粒体介导的细胞凋亡。GU等［9］研究结果显示，汉黄芩苷通过调控IRE1α通路促进人胃癌细胞凋亡和内质网应激。本研究中，CCK-8实验结果显示，汉黄芩苷对肝癌细胞HepG2增殖能力具有显著的抑制作用，且随着药物浓度的增加，肝癌细胞HepG2的增殖能力受到更加显著的抑制。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡，通过促进癌症细胞凋亡可延缓癌症的进展，减少癌细胞对周围组织的侵袭，从而达到治疗癌症的目的。Western blot实验结果显示，汉黄芩苷可上调肝癌细胞内凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3蛋白表达水平，同时下调Bcl-2蛋白表达水平。流式细胞学实验结果显示，汉黄芩苷可诱导肝癌细胞凋亡。上述研究结果显示，汉黄芩苷可通过抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡，从而发挥治疗肝癌的作用。

为了进一步明确汉黄芩苷促进肝癌细胞HepG2凋亡的信号调控机制，给予汉黄芩苷治疗的肝癌细胞AKT激动剂处理。有研究显示，AKT通路参与了细胞凋亡的调控过程。FRANKE 等［10］研究发现，AKT相关蛋白在细胞凋亡中的调控作用。HAN 等［11］研究发现，汉黄芩苷通过PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路抑制细胞生长，诱导线粒体介导的人结肠癌细胞自噬相关凋亡。本研究中Western blot结果显示，汉黄芩苷可有效抑制肝癌细胞HepG2内AKT蛋白磷酸化水平。给予AKT激动剂处理上调肝癌细胞HepG2内AKT蛋白磷酸化水平后汉黄芩苷对肝癌细胞HepG2凋亡的促进作用受到显著的抑制。由此可见，AKT信号通路在汉黄芩苷促进肝癌细胞HepG2凋亡过程中发挥重要的调控作用。

综上所述，汉黄芩苷通过调控肝癌细胞HepG2 AKT信号通路，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖发挥其抗癌作用。