VEGF 家族及其受体调控雌性动物生殖活动的研究进展

邬建飞，字向东

（西南民族大学动物科学国家民委重点实验室，四川成都 610041）

血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）于1983 年由Senger 及其同事首次分离，因其具有刺激血管通透性的能力而被确定为血管通透性因子（Vascular Permeability Factor，VPF），1989年Napoleone Ferrara 及其同事纯化得到相同的蛋白质，并发现该蛋白能够有效调节血管内皮细胞的增殖及分化，故将其重新命名为“血管内皮生长因子”。VEGF 家族成员对动物的多种生命活动过程起着重要的调控作用，具有促进血管生成、促进功能性淋巴管形成和促进软骨形成等功能，同时在治疗肿瘤、预防早产儿视网膜病变和治疗炎症等病理方面也发挥着重要作用。越来越多的证据表明，VEGF 对雌性动物生殖活动的顺利进行也起着不可替代的调控作用。本文综述了VEGF 家族的分类、受体的信号转导和生物学功能，再对VEGF 在卵巢、子宫、输卵管、胚胎发育和雌性动物生殖疾病中的作用进行梳理，为利用VEGF 提高雌性动物生殖能力提供理论基础。

1 VEGF 家族分类、受体信号转导及生物学功能

1.1 VEGF 家族的分类 VEGF 家族由哺乳动物中的VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子（Placental Growth Factor，PlGF）以及VEGF-E（orf病毒编码）和VEGF-F（蝰蛇毒液中分离）7 种分泌性糖蛋白共同组成，它们都含有由8 个间隔半胱氨酸残基组成的核心结构域，但哺乳动物VEGF 家族成员的序列同源性、染色体定位、mRNA 转录本大小和蛋白质大小等存在差异（表1）。VEGF-A 是VEGF 蛋白家族中最先被发现研究的成员，其在血管生成和血管发育上具有重要作用，基因包括8 个外显子，它们通过差异剪接得到5 种主要的同源异构体，再根据氨基酸数目的不同分别命名为VEGF、VEGF、VEGF、VEGF、VEGF和VEGF（图1），在这5 种异构体中，VEGF在细胞中的表达最丰富，是最有效的血管生成因子。VEGF-B 是由VEGF-B 基因编码的生长因子，基因在选择性剪接作用下产生VEGF-B和VEGF-B2 种同源二聚体，研究发现VEGF-B 广泛存在于代谢活性高的组织中，特别在心肌细胞、骨骼肌细胞、血管细胞和神经元组织中大量表达，VEGF-B 主要通过抑制相关凋亡相关基因的表达来抑制细胞凋亡，从而促进血管细胞、神经元和心肌细胞的存活。

图1 VEGF-A 的同源异构体[11]

表1 哺乳动物VEGF 成员间的差异

VEGF-C 作为前体蛋白产生，然后被前蛋白转化酶家族（Proprotein convertases，PCs）中的弗林蛋白酶、PC5 和PC7 激活，等位基因缺失会导致小鼠淋巴管发育不全，出现淋巴水肿致死现象，证明的表达对淋巴管系统发育至关重要。VEGF-D 是淋巴管生成中VEGF 亚组的第2 个成员，广泛分布于各种动物组织中，其中在胎儿的肺和皮肤中表达最高，其在结构上与VEGF-C 有48% 的相似性，也是生成淋巴管的重要活性因子。研究发现VEGF-C 主要作为淋巴管生长过程中的程序化调节因子，而VEGF-D 主要作为淋巴管生长的局部驱动因子，在另一方面，加工成熟的VEGF-D 比VEGF-C 表现出更强的血管生成能力。PlGF 是VEGF 家族的第2 个成员，基因通过可变剪接产生4 种不同的亚型，分别是PlGF-1、PlGF-2、PlGF-3 和PlGF-4，在妊娠各阶段的胎盘中均表现出高表达，其具有促进滋养层细胞生长分化的作用，同时还具有促进血管成熟的功能。

VEGF 家族除了哺乳动物中的5 种VEGF 外，还包含2 个特殊的成员——由orf 病毒编码的VEGF-E 和从蝰蛇毒液中提纯的VEGF-F。VEGF-E 具有刺激血管内皮细胞增殖和促进血管通透性的作用，其在结构上也与哺乳动物的VEGF 存在较高的相似性，因此，VEGF-E被归入VEGF 家族，研究发现用VEGF-E 治疗皮肤损伤可以增加伤口微血管密度并改善愈合伤口中血管的周细胞覆盖率，增强皮肤伤口的愈合能力。VEGF-F是从蝰蛇毒液中鉴定出的VEGF 家族的第七个成员，研究证明VEGF-F 广泛分布在多种毒蛇毒液中，基因的核苷酸序列具有高度保守性，但它们编码的蛋白质存在种间差异，VEGF-F 具有强烈的刺激血管内皮细胞增殖的作用，其最大活性几乎是 VEGF-A的两倍，与体内VEGF-A相比，VEGF-F 还具有强烈的降低动脉血压的作用。

1.2 VEGF 家族受体的信号转导 VEGF 家族成员主要通过与3 个跨膜酪氨酸激酶受体家族（VEGFRs）和2种神经纤毛蛋白（NRPs）的特异性结合发挥生物学功能，其中酪氨酸激酶受体家族包括VEGFR-1（小鼠中也称为Flt1）、VEGFR-2（人类中称为KDR，在小鼠中称为Flk1）和VEGFR-3（小鼠中也称为Flt4），神经纤毛蛋白包括NRP1 和NRP2，VEGFR 家族成员具有一定的相似性，都含有由免疫球蛋白（Immune Globulin，Ig）结构域、跨膜结构域、近膜结构域、酪氨酸激酶结构域和羧基末端结构域组成的配体结合结构域(图2)。血管内皮细胞中的VEGF-A 信号传导主要通过激 活VEGFR-2实现，VEGF-B、PlGF 和VEGF-A 是VEGFR-1 的高亲和力配体，VEGF-C 和VEGF-D 通过刺激VEGFR-3 的激活来介导淋巴管的发生。NRPs是一种单次跨膜受体，它们可以识别VEGF 家族中的所有成员，但在结合过程中表现出不同的偏好，NRP1 与VEGF-A、VEGF-B、VEGF-E 和PlGF 的肝素结合域相互作用，而NRP2 则与VEGF-A、VEGF-C 和VEGF-D相互作用。

图2 VEGF 家族与其受体结合情况[17]

VEGFR-1 是一种大小在180～185 ku 的糖蛋白，因响应VEGF-A、VEGF-B 和 PlGF 的结合而被激活。VEGFR-1 的酪氨酸磷酸化模式主要受PlGF 的影响，在PlGF 的刺激下，Tyr和 Tyr参与磷脂酶C-（PLC-）的结合和激活，进而增加细胞内Ca通量和促进1，4，5-三磷酸肌醇的生成,Tyr则与不同的含SH2 的蛋白结合,如PLC-、生长因子受体结合蛋白2（Growth Factor Receptor Binding Protein，GRB-2）、酪氨酸激酶衔接蛋白的非催化区（Non Catalytic Region of Tyrosine Kinase Adaptor Protein，NCK）和含SH2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Protein Tyrosine Phosphatase With Two Src-Homology，SHP-2) 等，进而激活Akt/Pkb 信号通路，Akt/Pkb 通路再通过磷酸化Bad 蛋白（Bcl-2家族蛋白）、Caspase9 蛋白和内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等来提高细胞存活率。VEGFR-2 是一种大小在210～230 ku 的糖蛋白，它能与VEGF-A、VEGF-C 和VEGF-D 结合产生作用，但它与VEGF-A 的结合亲和力只有VEGFR-1的1/10 倍。VEGF-A 与VEGFR-2 结合促进受体二聚体化，VEGF-A 与VEGFR-2 细胞外Ig 结构域的2、3 位点结合后，信号分子与VEGFR-2 细胞内结构域中的相应磷酸化位点结合，再激活下游介质，进一步完成血管内皮细胞的增殖、迁移、存活和渗透性的改变，实现形成和维持血管的生物学功能。VEGFR-3 是一种大小为195 ku 的前体蛋白，其被蛋白酶水解后产生1个N 端肽，该肽是二硫键的结合位点。VEGF-C 和VEGF-D 与VEGFR-3 的结合导致VEGFR-3 至少5 个酪氨酸残基位点磷酸化，这些磷酸化位点促进ERK1/2、Akt/Pkb 和JNK 通路中的信号传导，进而实现淋巴内皮细胞的增殖、迁移和存活等生物学过程。

1.3 VEGF 家族的生物学功能 VEGF 的生物学功能主要体现在生理性和病理性两方面。在生理性方面，骨细胞的生长过程伴随着基因的表达，利用VEGFR-1 嵌合蛋白或VEGF-A 拮抗剂干扰其表达后干骺端血管生成几乎被完全抑制，同时骨小梁形成受阻，停止干扰后毛细血管开始重新生成，软骨细胞逐渐恢复正常，这提示的正常表达对于干骺端血管的定向生长和软骨形成必不可少。VEGF 对早期胎儿的发育也至关重要，抑制的表达会导致胚胎发育异常，出现多器官血管缺陷、卵黄囊血岛内有核红细胞数量明显减少、肾器官衰竭等现象，同时胚胎的死亡率显著增加。mRNA 的表达还与卵巢上血管的生长发育密切相关，正常表达可以保障卵泡生长和黄体发育，抑制剂的表达会抑制黄体血管的生成，并延缓卵泡发育。在病理性方面，mRNA 在肿瘤发生过程中表达上调，抑制的表达可以显著降低肿瘤细胞的血管的生成和生长，实现更好的抗肿瘤效果。胎儿在早产情况下正常的视网膜血管发育停止，无血管的视网膜发育增加，在缺血/缺氧的驱动下表达上调，促进大量新生血管的生成，但这些新血管会异常渗漏到视网膜前间隙，发生纤维化，进而导致胎儿视网膜脱离和失明，临床试验证明向早产儿眼内注射抗VEGF 药物可以预防和治疗视网膜病变。VEGF 还与炎症和脑水肿的发生有关，的过度表达会诱导慢性皮肤炎症，同时大脑在损伤缺血的情况下脑组织及其受体水平升高，脑组织出现水肿，抑制剂对治疗脑水肿有积极作用。

2 VEGF 在雌性动物生殖活动中的调控作用

2.1 VEGF 在卵巢中的作用 VEGF 在卵巢卵泡期、黄体期和妊娠期3 个关键生殖阶段都表现出重要的调控作用。卵巢卵泡发育过程离不开营养物质、氧气和激素的滋养作用，这些物质的运输都需要通过复杂的血管网络实现，而VEGF 对血管的生成和功能维持都起着十分重要的调控作用，因此的表达对卵泡发育至关重要。研究发现，向母猪卵巢中直接注射基因片段可以增强卵泡周围血管的生成能力，促进卵巢中卵泡的发育；奶牛优势卵泡中的表达显著高于非优势卵泡，在受体方面，非优势卵泡中VEGF 可溶性受体维持在较高浓度，这会抑制的表达，而优势卵泡中VEGF 可溶性受体的表达降低，这有利于VEGF 与VEGFR-2 的结合，从而促进卵泡发育。研究发现向食蟹猴卵巢中注射VEGF 抑制剂会导致卵泡血管生成减少，窦状卵泡的募集减少，有腔卵泡发育受阻。Zhang 等利用2-甲氧基雌二醇抑制的表达，结果显示小鼠卵泡的血管生成受阻，闭锁卵泡数量显著增加。

排卵后，残留的颗粒细胞在LH 作用下开始形成富含毛细血管的黄体组织，卵巢开始进入黄体期，目前已经在人、牛、绵羊、猪、狗和大鼠等哺乳动物的黄体期各阶段的黄体细胞上均检测到VEGF 及其受体的表达，说明VEGF 对各种动物黄体的形成过程都发挥着重要的调控作用。Yamashita 等在母牛排卵后立即向其黄体内注射抗VEGF 抗体，结果显示黄体体积明显缩小、血浆中孕酮浓度降低，mRNA 表达下调，佐证了VEGF 对黄体功能实现是不可缺少的。研究发现不同物种黄体细胞中的表达存在时间差异性，在绵羊、牛上的高表达主要发生在黄体早期，在中期表达较弱，而在人、马、猪、猕猴等动物上的高表达主要出现在黄体中期，其表达强度可能会超过黄体早期。在黄体消退过程中，的表达随血管的溶解和血流量的减少而降低，的表达变化也调控着黄体的溶解过程。

雌性动物发生妊娠时，卵巢上的黄体会继续发育成为妊娠黄体，为胎儿的发育提供激素来源。Wulff 等在妊娠黄体颗粒细胞中成功定位到VEGF，并发现其在妊娠中期表达最高，Sugino 等也发现人妊娠6～8 周时，妊娠黄体中mRNA 表达量显著高于黄体期。Pauli 等向妊娠小鼠中注射抗VEGFR-2 抗体，发现小鼠妊娠黄体的体积缩小，黄体血管退化，孕酮分泌量下降，妊娠黄体的功能受到严重影响，证明VEGFR-2介导的内皮细胞信号对于维持妊娠期间黄体血管的功能至关重要，VEGF 在妊娠黄体中主要通过VEGF/VEGFR-2 通路实现生物学功能。

2.2 VEGF 在子宫内膜中的作用 子宫是早期胚胎发育、附植和妊娠的场所，同时还具有调节卵巢、帮助精子获能等功能。子宫内膜位于子宫内侧，其经历着周期性破裂和重塑，该过程伴随着血管系统的损坏与重建，研究发现许多细胞因子参与这一转化过程，其中VEGF 作为强有力的血管生成因子在这过程中发挥着核心作用。Gargett 等发现在子宫内膜增生期细胞中VEGF 的免疫组化染色强度明显高于非增生期子宫内膜，同时内皮细胞的增殖速率显著高于非增生期，说明VEGF 在子宫血管内皮细胞的增殖上发挥积极作用；研究发现的表达上调还有助于促进子宫内膜的血管生成和血管通透性增加，VEGF 对子宫内膜血管的生成也起着重要的调控作用。VEGF 对还月经期造成的子宫损伤具有修复和调节作用，在经后修复阶段，恒河猴子宫内膜上皮中mRNA 表达进一步显著增加，同时VEGFR-1和VEGFR-2 在血管上皮细胞中大量增加，证明VEGF参与了子宫内膜愈合和损坏血管的再生过程。

PlGF 是由单个PlGF 基因编码的一类二聚体多糖，是VEGF 的家族成员，其对子宫内膜也起着十分重要的调控作用。在大多数正常健康的组织中，PlGF 几乎不表达，但其在处于妊娠中的子宫内膜中表达强烈，这主要是由妊娠阶段子宫内激素分泌增加、局部缺氧和炎症等因素所诱导。Tayade 等研究发现基因缺失并不会导致小鼠血管缺陷，说明PlGF 在血管的发育和生长过程中的作用可以忽略不计，但的表达会对子宫自然杀伤（Uterine Natural Killer，uNK）细胞产生重要影响，基因缺失小鼠的uNK 细胞比正常小鼠更小、细胞质颗粒减少，同时缺失促进大量双核uNK 细胞早期分化，uNK 细胞的异常表现会诱导子痫前期样疾病，因此基因的表达对维持正常妊娠也不可缺少。

2.3 VEGF 在输卵管中的作用 输卵管是卵子进入子宫的通道，是精卵结合的受精部位，它还具有运送精子、卵子和分泌营养物质的功能。Gabler 等通过免疫组织化学发现VEGF 主要定位于牛输卵管的上皮细胞中，输卵管mRNA 在整个发情周期表达相对稳定，但受体和的表达呈周期变化，其中mRNA 在排卵前的表达显著上调。López等发现VEGF 主要位于猪输卵管上皮的分泌细胞和纤毛细胞中，少部分存在于固有层细胞和肌层血管中，及其主要受体和在整个发情周期中的输卵管中均有表达，但表达存在空间和时间上的差异，和在猪输卵管壶腹部表达较高，而mRNA 在峡部表达较高，mRNA 在整个发情期中较为稳定，而的表达在排卵前的壶腹部和峡部显著增加。血管的充分形成对于输卵管生理功能的实现必不可少，而血管的形成主要受VEGF 及其受体的调控，Pinto-Bravo 等研究发现马输卵管中及其受体的表达变化情况与微血管生成模式一致。综上研究可以发现VEGF 及其受体在多个物种的输卵管上均有定位和表达，推测VEGF 对输卵管的血管形成、血管通透性的改变以及输卵管液体的分泌不可缺少。

2.4 VEGF 在胚胎发育过程中的作用 胚胎进入子宫腔后，在子宫液的介导下游离胚胎开始与子宫内膜产生作用，目前已经在子宫液中发现多个VEGF 家族成员，如VEGF-A 和PlGF。VEGF 在胚胎发育的整个过程中被检测到，VEGF 治疗可以促进囊胚生长，增加囊胚细胞数量，改善子宫内膜上皮细胞黏附能力，并促进胎儿的肢体发育。研究发现PlGF 也可以增加囊胚细胞数量，促进囊胚生长，同时改善子宫内膜上皮细胞的黏附能力，说明VEGF-A 和PlGF 在胚胎发育中都发挥着重要作用。除了子宫内膜来源的VEGFs 对胚胎的影响外，胚胎来源的VEGF 家族成员也参与了子宫微环境的调节，例如胚胎来源的VEGF-A 能够刺激子宫内膜血管生成，使得胚胎能够直接在植入部位生成血管。综上所述，尽管人们对胚胎和子宫内膜的作用方式还未完全了解，但VEGF 作为重要的生长因子承担着串联胚胎和子宫内膜相互作用的使命，并以特定的方式影响胚胎着床。

2.5 VEGF 在雌性动物生殖系统疾病中的作用 研究发现，VEGF 对多囊卵巢综合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）、子宫内膜异位症（Endometriosis）、子痫前期（Preeclampsia，PE）、习惯性流产（Recurrent Miscarriage，RM）和反复种植失败（Recurrent Implant ation Failure，RIF）等多种雌性生殖系统疾病的发生和治疗都产生影响。PCOS 是一种常见的内分泌疾病，PCOS 患者会出现内分泌紊乱、卵巢增生和血管增多等特征，患者的排卵率显著降低。研究发现PCOS 患者卵巢中表达增加，这可能与PCOS 患者卵巢间质血管增多和卵巢过度刺激综合征（Ovarian Hyperstimulation Syndrome，OHSS）发生率增高有关，在经VEGF 抑制剂治疗后，PCOS 大鼠的卵巢囊肿症状得到缓解，卵泡发育得到明显改善，同时排卵率显著增加。子宫内膜异位症是育龄妇女不孕的常见原因，子宫内膜异位症患者子宫内膜中的表达显著上调，抗VEGF 治疗可以延缓子宫内膜异位症的发生，这可能成为治疗子宫内膜异位症的新策略。

PE 是一种以高血压和蛋白尿为特征的严重的妊娠并发症，胎盘血管生成缺陷是导致PE 疾病的重要因素。Maynard 等发现PE 患者血清和胎盘中可溶性VEGFR-1 表达上调，胎盘中过量的可溶性VEGFR-1 会竞争性结合VEGF-A 和PlGF，表达失衡会导致内皮功能障碍，进而导致高血压和蛋白尿的发生，目前有关研究希望通过促进促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡而降低PE 的发病率。

RM 是指人妊娠24 周前连续3 次或3 次以上自然流产，研究表明VEGF 家族成员表达的改变可能是RM 的一个诱导因素。Lash 等研究发现RM 患者子宫内膜血管平滑肌细胞、内皮细胞和腺上皮细胞中的表达降低，Banerjee 等也发现RM 患者着床窗口期子宫内膜中的的表达较低，这2 个研究都指明在子宫内膜中的表达下调可能是导致RM 患者流产的重要原因，但VEGF 在RM 中的作用机制有待进一步研究阐明。

RIF 指40 岁以下的妇女通过3 次以上胚胎移植或累计移植超过4 枚优质胚胎均未能成功受孕的情况。Bansal 等研究发现RIF 患者血清中的表达水平显著高于正常妇女，但Chen 等研究发现RIF 患者在胚胎植入时子宫内膜中的表达显著下调，VEGF 对RIF 患者胚胎着床的影响还需要进一步研究。

3 小结及展望

VEGF 从发现之初就广受关注，因其在血管生成、改变血管通透性以及淋巴管生成上的重要作用而成为研究热点。随着研究深入，VEGF 家族成员不断被发现，每个成员的结构、受体和作用机制等被不断了解，相关生物学功能的研究被不断拓宽。VEGF 在雌性生殖系统上的功能研究已被大量开展，目前发现VEGF 可以促进优势卵泡的发育、促进黄体功能、促进子宫血管系统的形成和促进胎儿发育等诸多功能，但同时也发现的异常表达可能导致部分雌性动物的生殖疾病。因此，在现有研究基础上继续探究VEGF 在雌性生殖系统上的作用机制，同时合理利用VEGF 来提高雌性动物的生殖能力和预防有关生殖疾病等都具有重要的现实意义。